Dec. 01, 2022

カニクイザル酸性キチナーゼ：頑強な性質とその応用利用
（Glycoforum. 2022 Vol.25 (6), A16）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.25A16J

上原 麻衣子 / 小山 文隆

上原 麻衣子

氏名：上原 麻衣子
工学院大学先進工学部生命化学科
2017年3月 工学院大学工学部応用化学科卒業
2019年3月 工学院大学大学院工学研究科化学応用学専攻　博士前期（修士）課程修了
2022年3月 工学院大学大学院工学研究科化学応用学専攻　博士後期課程修了（工学博士）

小山 文隆

氏名：小山 文隆
工学院大学先進工学部
1980年3月 茨城大学農学部農芸化学科卒業、1982年3月 東北大学大学院農学研究科農芸化学専攻博士前期修了、 1985年3月 同大学院同研究科同専攻博士後期修了（農学博士）、 1985年4月 三菱化成生命科学研究所・特別研究員、 1987年4月 藤田保健衛生大学医学部・助手 、 1992年9月 東京大学医学部・講師、 1996年4月 東京大学大学院医学系研究科・講師、 2002年4月 理化学研究所脳科学総合研究センター・研究員、 2009年4月 工学院大学工学部応用化学科・教授、 2015年4月 工学院大学先進工学部生命化学科・教授、 2021年4月 工学院大学先進工学部長

はじめに

キトオリゴ糖は、キチンまたはキトサンが分解することで生成され、抗菌、抗がん、抗炎症などの生理活性を有する。酵素によるキトオリゴ糖の生成は、安全性とその簡便さから多くの注目を集めている。我々は、カニクイザルが胃において、酸性キチナーゼ (acidic chitinase, CHIA) mRNA を高いレベルで発現していることを明らかにした。カニクイザル CHIA は、強酸性を含む幅広い pH 条件下において、熱耐性を有する頑強なキチナーゼ活性を有していた。さらに、カニクイザル CHIA は、強酸性および高温条件下において、不活性化することなく、キチンとキトサンを効率よく分解し、キトオリゴ糖を生成した。我々は、農学および医学領域におけるカニクイザル CHIA の応用を提案したい。

1. 序論

キチンは、N-アセチル-D-グルコサミン (GlcNAc) が β-1, 4 結合した直鎖状の多糖で、甲殻類、昆虫、線形動物、真菌類の構成成分である1,2。キトサンは、D-グルコサミン (GlcN) と GlcNAc で構成される多糖で、キチンが脱アセチル化されることで生成される。

キチンまたはキトサンの分解産物であるキトオリゴ糖は、抗菌、抗がん、抗炎症性の生理活性を有し、薬物伝達物質としても機能することが知られている3-7。さらに、植物成長における生物刺激作用をもつことから、バイオ農薬およびバイオ肥料として利用されている7,8。

キチナーゼは、キチンを加水分解する酵素である。ほ乳類はキチンを合成していないが、その分解酵素であるキチナーゼを発現している。マウスやヒトでは2種類知られており、キトトリオシダーゼ (Chitotriosidase, CHIT1) と酸性キチナーゼ (CHIA) である2,9,10。これまでの研究で、CHIA は病態生理学的な条件下で重要な役割を果たしていることが示されている。まず、疾患との関係では、CHIA はヒトの喘息と関連し11-15、さらに、Chia 欠損マウスを使用した研究で、CHIA は肺機能の保持のために、気道でキチンを分解する酵素であることが報告されている10,16。他方、Chia は、昆虫の外骨格を構成するキチンを分解する酵素であり、雑食・食虫性動物の胃で高発現し、消化器系条件下で高いキチン分解能を有することが明らかになった17-20。

カニクイザル (Macaca fascicularis) は、カニなどの甲殻類、昆虫を含むキチン含有生物を食べることが知られており、非ヒト霊長類動物モデルの1つである21-23。カニの甲羅の主要成分はキチンなので、我々は、2016年、カニを食べるカニクイザルが、強力なキチナーゼを有していると期待し研究を開始した。

我々は、カニクイザル酸性キチナーゼ (CHIA) の遺伝子発現解析、酵素化学的性質、キトオリゴ糖生産への応用の可能性を提唱する。

2. カニクイザルにおける CHIA の発現

我々は、real-time 定量 PCR (qPCR) システムを用いて、カニクイザルにおけるキチナーゼ遺伝子発現解析をおこなった。カニクイザル主要 10 組織の total RNA の解析し、mRNA レベルを測定した。CHIA は胃で特異的に発現しており、CHIA mRNA はカニクイザルの胃において主要な転写物であることが分かった（図 1）。

図1
図 1. カニクイザル組織における CHIA mRNA の発現（左）、 カニクイザル胃組織における遺伝子発現の比較（右）

次に、カニクイザルの胃における CHIA mRNA の発現レベルを評価するために、マウス、カニクイザル、ヒトでの遺伝子発現レベルの種間比較を行った。カニクイザルの胃における CHIA mRNA レベルは、マウスの胃における Chia の発現レベルに匹敵していた。このことから、カニクイザルは胃で CHIA を大量に発現していると判断した（図 2）。

さらに、カニクイザル、マウス、ヒトの胃組織抽出液のキチナーゼ活性を検討した。CHIA が大量に発現していたカニクイザルの胃組織から非常に強いキチナーゼ活性が検出された（図 3）。キチナーゼ mRNA レベルの種間差は、基本的に、キチナーゼ活性レベルの差に反映されていた。

これらのことから、カニクイザル CHIA は強いキチナーゼ活性を有する可能性が強く示唆された24。

図2
図 2. マウス、サル、ヒト間での胃組織における遺伝子発現の比較
図3
図 3. カニクイザル胃組織抽出液のキチナーゼ活性

3. カニクイザル CHIA の酵素化学的性質

次に我々は、カニクイザル CHIA を組換えタンパク質として大腸菌で発現した。まず、カニクイザル CHIA の pH 依存性を検討した。カニクイザル CHIA は、pH 5.0 で最も高い活性を示し、pH 1.0-7.0 条件下においても強いキチナーゼ活性を保持していた（図 4左）。カニクイザル CHIA は、マウス Chia よりも、pH 2.0 においては 2 倍、pH 5.0 においては 16 倍、pH 7.0 においては 10 倍活性が強かった。また、両酵素の至適条件下におけるキチナーゼ活性 (カニクイザル CHIA: pH 5.0、マウス Chia: pH 2.0) を比較したところ、カニクイザル CHIA が 3 倍の強さの活性を示した （図 4右）。

図4
図 4. カニクイザル CHIA の pH 依存性およびマウス Chia との比較

次に、カニクイザル CHIA の温度依存性を検討したところ、pH 5.0 (カニクイザル CHIA の至適 pH 条件) 条件下における至適温度は 65°C であった。70°C においても高いキチナーゼ活性を保持していた（図 5）。

さらに、カニクイザル CHIA は、酸耐性および熱耐性を有していた。このように、カニクイザル CHIA が様々な条件下で強い活性を有する頑強な酵素であることが分かった25。

図5
図 5. カニクイザル CHIA の温度依存性

4. カニクイザル CHIA によるキチンおよびキトサンの分解

カニクイザル CHIA に 70 °C までの熱耐性があったことから、高分子基質分解の温度条件を検討した。カニクイザル CHIA は、至適 pH 条件である pH 5.0 において、生体内条件（37°C）よりも高温条件下（50°C）でより多くの分解産物を生成した（図 6左）。さらに、50 °C における長時間反応でも、カニクイザル CHIA は失活することなく基質分解を続けた（図 6右）。

図6
図 6. 生体内条件（37 ℃）と高温条件（50 ℃）におけるカニクイザル CHIA によるキチン分解の比較（左）、 50 ℃ におけるカニクイザル CHIA によるキチン分解の経時変化（右）

次に、50°C、pH 2.0 または pH 5.0 条件下で、3 種類のキチン基質 (結晶性 α-キチン、コロイダルキチン、P-キチン)、2 種類のキトサン基質（ブロック型キトサン、ランダム型キトサン）をカニクイザル CHIA を用いて分解し、fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis（FACE）法で解析した18,19,24,26,27。キチン基質からは、主に (GlcNAc)2 が生成された。どのキチン基質に関しても、反応時間の増加と共に、分解産物量が増加した。キチン基質に関しては、P-キチンでより多くの分解産物が生成された（図 7）。

キトサン基質からは、多様なキトオリゴ糖が生成された。どのキチン基質に関しても、反応時間と共に、分解産物量が増加し、さらに、得られるキトオリゴ糖のパターンも変化した。分解するキトサン基質の種類、pH 条件が得られるキトオリゴ糖の差に影響した。また、キトサン基質に関しては、ランダム型キトサンでより大量な分解産物が生成された（図 8）28。

図7
図 7. カニクイザル CHIA によるキチン基質の分解
図8
図 8. カニクイザル CHIA によるキトサン基質の分解

5. 今後の展望

化学的または酵素的処理により、キチンとキトサンからキトオリゴ糖が生成される。ほ乳類由来の酵素によるキトオリゴ糖の生成は、安全性とその簡便さから、その生成物の価値を高める。我々は、カニクイザルCHIAが、マウスChiaよりも強い活性を有することを明らかにした。そのキチナーゼ活性は、熱耐性と酸耐性を伴い、幅広い pH 条件下で高い活性を示した。さらに、キチンおよびキトサンの分解で、カニクイザル CHIA が、中程度のサイズのキトオリゴ糖の生成に有効な酵素であることも示した。これらのキトオリゴ糖は、農業領域における植物成長促進剤として利用できる7,8（図 9。

Chia 欠損マウスでの研究では、キチンが気道に蓄積し肺線維症を引き起こすが、活性のある酵素を投与することで改善できることが報告されている10,16。ヒトでは、CHIA が喘息に関連していると報告されている11-15。ヒトにおけるキチナーゼ活性レベルの上昇は、肺疾患の予防、治療につながる可能性が考えられる。カニクイザル CHIAは、ヒト CHIA との相同性が高いため、将来的な応用利用につながる可能性が考えられる（図 9）。したがって、カニクイザル CHIA は、農学および医学における利用を目的としたキトオリゴ糖の生産に応用できる可能性がある（図 9）。

図9
図 9. カニクイザル CHIA の応用可能性

References

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