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Oct 01, 2020

新シリーズ「ガレクチン」
～実験プロトコールおよび未解決問題（講話）を始めるにあたって
（Glycoforum. 2020 Vol.23 (5), A14）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.23A14J

平林　淳 / 佐藤 祥子

平林

氏名：平林　淳
国立研究開発法人 産業技術総合研究所、理学博士
1982年東北大学修士取得後、帝京大学薬学部生物化学教室（笠井献一教授）に赴任、動物レクチンの研究に従事。1999年、GlycoXV（東京）にてグライコミクスを提起、2002年産業技術総合研究所（つくば）に異動、NEDO「糖鎖エンジニアリング」プロジェクト等に参画。2006年糖鎖医工学研究センター・副センター長、2012年幹細胞工学センター・首席研究員を歴任。現在、産業技術総合研究所・特命上席研究員、日本糖質学会理事、日本糖鎖科学コンソーシアム副会長、香川大学および横浜市立大学客員教授。

佐藤祥子

氏名：佐藤 祥子
ラヴァル大学医学部・医学部付属研究所、薬学博士
千葉大学薬学部卒業。1987年より東京大学医科学研究所大学院で木幡教授の指導を受ける。その間ロンドンの国立医学研究所にてR. Colin Hughes博士の下でガレクチン-3研究行う。1994年東京大学博士号取得。ついでスタンフォード大学のDr. Ron Kopito研究室でポスドク研究員として、遺伝性嚢胞性線維症への化学療法に関する研究を行った。1999年よりカナダ・ラヴァル大学医学部感染症研究センター糖質生物学研究室主任研究員、ラヴァル大学医学部准教授。2010年同大学同部教授。2003年以降同部門Bioimaging platformの長兼任。

この度、グライコフォーラムの新シリーズとして「ガレクチン」を開始する運びとなった。これは、昨今話題の多いガレクチンについて、実験プロトコールを関係者と広く共有するとともに、通常学術誌ではテーマとして取り上げることが難しい「未解決問題」を扱うという全く新しいコンセプトに基づく企画である。産総研の平林とラヴァル大学の佐藤が編集を務めさせていただく。ガレクチンは進化的に保存されたアミノ酸配列とβ-ガラクトシドに対する糖結合活性を有するタンパク質家系（PfamID:PF00337）である1。それらは多細胞動物で大きなグループを形成する糖結合タンパク質で、長い研究史を持つとともに（図 1）、がん、免疫、発生、感染など、幅広い生命現象に関与することが知られている（ガレクチン機能のアトラスについては図 2を参照、文献2を基に作成）。このように、研究の歴史が長いにもかかわらず、ガレクチンには残された多くの謎がある。笠井教授はかつてこの問題について「ガレクチンの七不思議」と表現し、以下の疑問を取り上げた（原文そのまま）3。1）ガレクチンの総合的な任務は何か。2）ガレクチンは細胞内タンパク質として設計されているのに、なぜ細胞の外に見つかるのか。3）細胞の中からどうやって外へ出るのか。4）なぜガレクチンはすべてガラクトースに特異的なのか。5）ガレクチンの細胞内および細胞外のリガンドは何か。6）酸化されて失活する危険性が高いのに、細胞外に存在するのは何故か。7）ガレクチンとマメ科レクチンのトポロジーが同じなのは何故か。正直、これらの疑問が四半世紀も前に出されながら、全くその答えが見つかっていないことに驚く。

図1
図 1. ガレクチン研究史における出来事．編者（平林、佐藤）の私見により初期の出来事を中心に選別した。
* 本分類名は、当初研究されていたガレクチン（ガレクチン-1など）が、2-メルカプトエタノールなどのチオール（-SH）性還元剤非存在下で糖結合活能を失うという観察に基づいている。しかし、容易に酸化的失活を起こすガレクチン-1などの分子はむしろ例外であって、他の多くのガレクチンには当てはまらないことが後に判明する。この混乱がいわば一つの契機ともなり、1994年、Barondesらによるガレクチンの統一名称の提唱へと至る。


図1のリファレンス
図2
図 2. ガレクチン−アトラス
ガレクチン（ピンク）、ガレクチンのリガンドを含むコンプレックス型やムチン型の糖鎖（水色）、及びオリゴマンノース型糖鎖（薄黄色）の細胞内外の存在場所をそれぞれ示した。また、ピンクのサークルはガレクチン分子を示す。

A. 細胞質に存在するガレクチンは、制御分泌経路(a)及び損傷した細胞からの受動的な放出(b)により細胞外環境に放出される。制御分泌経路の場合は、ガレクチンは4つの経路、すなわちトランスポーター、ベシクル、およびオートファジーを介した経路、またはエクトサイトーシスを介した経路により分泌されることが知られている。

B. 細胞外環境に放出されたガレクチンは、時空間的かつ状況依存的に多くの機能を発揮する。それらの機能のほとんどは、ガレクチンの糖鎖結合活性とその結合多価性(multivalency)に依存している。この図にはこれらの機能の一部を記した。

C. 細胞質内においては、ガレクチンは糖鎖−ガレクチンとタンパク質−ガレクチン相互作用を介してさまざまな応答を仲介する。 これらの機能の一部を記した。

 詳細な説明については、佐藤によるグライコフォーラムの記事または論文を参照（S. Sato: Mammalian cytosolic galectins act as damage-associated molecular patterns, resolutions-associated molecular patterns, and pattern-recognition receptors in innate immunity, Comprehensive Glycoscience 2nd Edition, Elsevier, in press）。

しかし、第一の疑問については、その文献中でユーモアを交えガレクチンをこうも表現している。「賢い糊、お役所仕事でないお役人、万能の脇役」と。疑問点2、3、5と6はいずれもガレクチンの細胞質と細胞外における両局在と2つの機能についてである。これらの問いは突き詰めればガレクチンの起源に関するものである。いわゆる「ニワトリと卵」の関係といえよう。すなわち、「ガレクチンの祖先はレクチンだったのか、あるいはそうではなく、レクチン以外であったものが後にレクチンに進化したのか」。現在まで見つかるガレクチンには例外なく分泌のためのシグナル配列がない。また、糖鎖修飾もされていないことから、ガレクチンの祖先タンパク質は細胞質タンパク質として誕生したにちがいない。しかし、細胞質には基本的に糖鎖はなく、よって細胞質におけるガレクチンの機能も近年まで不明であった。

残る疑問の2つ、4と7はタンパク質の分子骨格（β-サンドイッチ/ジェリーロール構造）と糖結合特異性に関するものである。ここで新たに問われるのは「なぜガレクチンの特異性はβ-ガラクトシドに収束するのか」という点だ。しかし、だれも先験的な答えを持ち合わせてはいないようである。これもガレクチンの起源と進化に関する問題であるが、果たして我々は構造生物学的な立場からこの問いに答える有用なヒントを見出せるのであろうか。

さて、本シリーズ「ガレクチン」であるが、二部構成になっている。第1部はガレクチン発現に関する実験プロトコールである。香川大学の西望氏からの好意で、本フォーラムに氏の詳細な実験プロトコールが寄せられたのが、本シリーズ企画の始まりである。ガレクチン研究者であれば、西氏がヒトをはじめとする生物由来の組換え体ガレクチンを数多く作製発現し研究されていることを知っているだろう。その中には酸化的失活を起こさなくなった、システインのないガレクチン–１（Gal-1）変異体（論文ではCSGal-1と命名）4や、Gal-8やGal-9等の直列反復型ガレクチンのリンカー領域を除去した変異体（G8Null、G9Null）5といった実験上有用なものも多い。これらの有用な変異体を含む多くの組換えガレクチンの発現プラスミドは、これも氏の好意によって公共のバイオリソースセンター（理研、和光市）に寄託され、希望者には無償で配布される。この実験プロトコールはこれまでガレクチン研究をしていた研究者にとって恩恵であるばかりでなく、組換えタンパク質の発現に挑んだことのない若手研究者にとってもありがたい。比較的簡単といわれている大腸菌を用いたレクチンの発現や精製でさえ、素人が行うとうまくいかないことがある。原著論文には書かれていない、見落としがちな落とし穴が実際はたくさん潜んでいるからだ。今回公開されるプロトコールは、以下4つの部分で構成されている。すなわち、1）27ステップからなるガレクチンタンパク質の発現と精製の「実験プロトコール」（有用な注意事項付き）、2）個々のガレクチンに関する「コメント」、3）関連実験（SDS-PAGE前にガレクチン試料を濃縮する方法）や特別コメント（例、酸性条件下でGal-9を精製するコツ）などの「補足事項」である。

第2部は「ガレクチンの未解決問題」と銘打った一連の「談話」からなる。冒頭述べたように、発見以来ガレクチンには多くの謎が未解決のまま残されているが、それらの多くが進化に絡む、いわば解決不可能な問題でもある。ここでは敢えてそこに焦点を絞る。すなわち、長年ガレクチン研究に携わってきた著名研究者をこのシリーズに招き、彼らにいくつかのガレクチン未解決問題について自由に語ってもらう、という企画である。彼らが語る持論はときに読者を魅了する物語であったり、大胆な仮説、またあるときには興奮をそそる幻想であったり、という具合に。これがまさに編者らの狙いであり、読者はグライコフォーラムという場を訪れさえすれば、ガレクチンの謎について一緒に考え、著名な先人たちの透徹された思考や展望に触れる機会を得るのである。いくつかのガレクチン特集号が今まで編纂されているが 6-9、我々の知る限り、このような企画は他に例がない。企画の趣旨を理解し快く参加を受け入れてくれた下記の著者達に厚く感謝する（掲載順は変更される可能性及び新たな著者が参加する可能性もある）。ガレクチンと糖鎖科学のフォーラムの場にユニークな将来展望が開けることを切に願う。

■ Kenichi Kasai (Teikyo University, Japan)
■ Hans-Joachim Gabius (Ludwig-Maximilians-University Munich, Germany)
■ Hakon Leffler (Lund University, Sweden)
■ James W. Dennis (Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada)
■ Tadasu Urashima (Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Obihiro, Japan)
■ Sachiko Sato (Laval University, Quebec City, Canada)
■ Jun Hirabayashi (AIST, Tsukuba, Japan)

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