Feb. 02, 2026

ENGaseによる糖鎖工学
（Glycoforum. 2026 Vol.29 (1), A1）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.29A1J

山本 憲二 / 千葉 靖典

山本 憲二

氏名：山本 憲二
京都大学名誉教授、石川県立大学名誉教授
1979年に京都大学農学部にて学位を取得。1976年に京都大学農学部食品工学科の助手に採用され、1999年に京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻の教授に就任。2010年に定年退職後、石川県立大学生物資源工学研究所の教授に就任。2017年に定年退職後、2年間、特任教授を経た後、2019年より和歌山大学産学連携イノベーションセンターの客員教授に就任。2025年に退職。

千葉　靖典

氏名：千葉　靖典
国立研究開発法人産業技術総合研究所　生命工学領域　領域長
1994年 東北大学大学院農学研究科で学位（博士（農学））を取得。同年 日本学術振興会特別研究員、1996年 キリンビール（株）ポスドクフェロー、1999年 NEDO産業技術研究員を経て、2001年より産業技術総合研究所にて若手任期付研究員として勤務。2006年 同所 主任研究員、2014年 同所 研究チーム長、2022年 同所 細胞分子工学研究部門 研究部門長、2023年 同所 生命工学領域 副領域長、2025年より現職。

序文

エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ (ENGase)は、様々な生物が保有する糖鎖を切断する酵素であるが、その触媒残基を改変することにより、グライコシンターゼとしてN-型糖鎖の改変へ活用できることが明らかとなってきた。

本シリーズでは糖鎖工学に関わるENGaseの研究の進歩について、それぞれの課題に取り組む研究者に解説して頂く。

1. はじめに

糖質科学の分野の発展において、糖質の機能とその意義を明らかにするためにオリゴ糖の合成とその構築が不可欠である。新しいオリゴ糖を創造することや有益な機能を付与するために化合物にオリゴ糖を付加することは糖質工学の重要な研究課題である。オリゴ糖の合成には化学的な方法が良く確立されているが、それらの方法は多くの手間がかかり、保護や脱保護といった複雑な段階を要する。一方、酵素を用いたオリゴ糖の合成法は高度な立体特異性や位置選択性に関しての利点がある。それ故に生体における生合成と同様にオリゴ糖の合成は糖転移酵素を用いて行うことが可能である。1982年にWongらは糖ヌクレオチドの再生系と糖転移酵素をカップルした優れた方法を報告して以来、酵素を用いたさまざまな方法が糖質の有用な化学-酵素合成法として認められてきた1。この化学-酵素合成法は化学合成の柔軟性と酵素合成の特異性を結び合わせたものであり、均一な複合糖質や新規なオリゴ糖の合成のみならず、天然では見られない糖修飾化合物の合成などに広く使われるようになった。

最近、構造が正確で均一なオリゴ糖や複合糖質の合成について大きな進歩が見られている。機能的な研究や生物医学への応用への必要性が、構造が均一なオリゴ糖や複合糖質を調製する化学的あるいは生化学的な方法の急速な発展を促している。化学的方法に対して、酵素的な糖の付加方法は糖残基を保護することが不必要であり、アノマー配置や高い位置選択性の効果的な制御が可能である。糖転移酵素は通常、酵素的な糖修飾反応に用いられるが、糖を付加した化合物の合成にも利用され、糖供与体として糖ヌクレオチドが使われて通常は厳格な基質特異性を有している天然の酵素である。一方、グリコシダーゼは糖代謝において加水分解の働きを有し、糖の結合を開裂する酵素であるが、多くのグリコシダーゼはさまざまな化合物の水酸基に糖残基を転移する糖転移活性をも有しており、化合物に糖を付加する糖転移活性に対する注目が増している。糖転移酵素が触媒する糖転移反応とは異なってグリコシダーゼが触媒する糖転移反応は、調製済みの糖供与体を用いることができることや酵素の入手が比較的容易であることなど、いくつかの利点がある。多くのグリコシダーゼは様々な材料から大量に調製することが容易でもある。さらに、糖転移酵素が1つずつ単糖を付加してオリゴ糖を伸長するのとは対照的に、エンド型のグリコシダーゼは糖転移活性を介して、一段階の反応により受容体へ大きなオリゴ糖をひとまとめに簡単な方法によって転移することができる。

タンパク質への糖鎖の付加は、細胞間の情報伝達や発生、免疫応答などの多くの重要な生物学的プロセスに不可欠な役割を果たす。これは翻訳後修飾の中で最も多様な形態であり、タンパク質のフォールディングや安定性、血液での寿命など、タンパク質の重要な特性に大きな影響を及ぼす。糖ペプチドや糖タンパク質を均質な形で得るために開発された数多くのアプローチの中で2、本総説では、糖鎖工学における最も有用な合成ツールの１つとして、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ENGase）に様々な観点から焦点を当てる。

2. エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ENGase）

ENGaseは種々の糖ペプチドや糖タンパク質のアスパラギン結合型（N-グリコシド結合型）糖鎖のコア部位のジアセチルキトビオース（GlcNAcβ1-4GlcNAc）基を加水分解して開裂するエンド型グリコシダーゼとして知られている。全てのN-結合型糖鎖はペプチドまたはタンパク質のアスパラギン残基に結合する同じ５糖のコア構造（Man3GlcNAc2）を有しており、ENGaseは１残基のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）をペプチドまたはタンパク質に残すというユニークな酵素活性を示す。この酵素はペプチドまたはタンパク質の糖鎖とアグリコン（配糖体の非糖部分）の両方を傷つけることなく遊離することができるために、遊離した糖鎖ともう一方に残ったペプチドまたはタンパク質の双方の機能の解析が可能であり、糖鎖生物学の分野においては非常に便利で不可欠なツールである3。

ENGaseは細菌や酵母、糸状菌、植物、マウス、ヒトなどの異なった種類の広い範囲の起源から見つかっており、異なる糖に対する特異性を持った種々の酵素が見出されている。最近、この酵素は腸内細菌から頻繁に見出され、腸管におけるN-グリカンの構造の違いは腸内細菌叢の組成に影響を与えることから、腸内に占有する菌叢がENGaseによって濃縮されることがイメージされ、腸内細菌による基質の獲得がN-グリカンに対するENGaseの特異性に依存することが示唆される4。これらのENGaseが作用する糖鎖は、高マンノース型、ハイブリッド型、複合型の幅広い糖鎖に特異性を示す。ヒトの腸内細菌は消化管において同じN‐グリカン基質を最適に代謝するために機能的に異なるENGaseを発現する進化的な戦略を採用し、これらの酵素は異なる腸内細菌の別々のPULs（polysaccharide utilization loci多糖利用遺伝子座）内にコードされることが最近報告されている5。

ENGaseの基質特異性は糖鎖工学のツールとしての有用性を考慮する上で重要である。糖鎖工学のためのツールとして酵素を利用する場合、遺伝子のデータベースを利用して遺伝子操作によって組換え酵素を得ることができるが、動物、植物、その他の起源の酵素よりも微生物起源の天然の酵素を得ることは容易である。しかし、同定されているいくつかの微生物のENGaseは高マンノース型またはハイブリッド型の糖鎖、あるいはその両方に作用するが、動物起源のほとんどの糖タンパク質に存在する複雑な型の糖鎖には作用しないことが多い。それらのENGaseにはStreptomyces plicatus 由来のEndo-H6、Arthrobacter protophormiae 由来のEndo-A7やElizabethkingia meningoseptica 由来のEndo-F18が含まれる。一方、Mucor hiemalis 由来のEndo-M9、Streptococcus pneumoniae 由来のEndo-D10、Elizabethkingia meningoseptica 由来のEndo-F311、Bifidobacterium longum sp. infantis 由来のEndo-Bl-112やStreptococcus pyogenes 由来のEndo-SとEndo-S213、Ogataea minuta 由来のEndo-Om14は糖ペプチドあるいは糖タンパク質の複合型糖鎖に作用することが報告されている。これら上記のENGaseの多くは市販されており、糖鎖工学の研究における有効なツールとして用いられている（Table 1）。

Table 1. Various useful microbial ENGases for the glycoengineering

table1

一次構造に基づいてENGaseには二つのタイプがあり、一つはグリコシドヒドロラーゼ（GH）ファミリー18として分類され、他方はCarbohydrate Active enZymes（CAZy）データベースにおいてGHファミリー85として分類されている。全てのGHファミリー18の酵素は活性基に２つのカルボン酸残基、すなわちグルタミン酸とアスパラギン酸を有している一方、GH85ファミリーの酵素は１残基のカルボン酸残基、すなわちグルタミン酸しか有していない。もう一方の重要な触媒残基はアスパラギンである。全てのENGaseは８つのα-ヘリックスと８つの平行なβ-シート構造からなる同じ(β/α)8-TIM バレル構造を有する。同じ酵素活性を示しながら、GHファミリー内のほとんどの酵素は25～30％の同一配列しか示さず、これらの酵素の間には、異なる触媒機構と異なる基質特異性を示す多くの違いがあることを示唆している。

多くのグリコシダーゼは、グリコシド結合の加水分解に関わる加水分解活性に加えて、種々の化合物の水酸基への糖部分の転移に関わる糖転移活性をも示すことがよく知られている15。エンド型グリコシダーゼの糖転移活性は水酸基を有するさまざまな化合物にオリゴ糖を転移し付加するために有用である16。それ故にエンドグリコシダーゼの糖転移活性を利用することは、ペプチドやタンパク質に糖鎖を付加するための極めて有用な手段である。ENGaseの糖転移活性は次のような反応を触媒すると考えられる。

R-GlcNAc-GlcNAc-Asn（糖供与体）+ GlcNAc-Asn-R’（受容体） →  
R-GlcNAc-GlcNAc-Asn-R’（糖転移生成物）+ GlcNAc-Asn
（R:オリゴ糖鎖, R’:ペプチドまたはタンパク質）

しかし、全てのENGaseが糖転移活性を有しているわけでは無い。我々が知る限りでは糖鎖を遊離するためのツールとして一般的に使われるEndo-Hは糖転移活性を示さず、糖鎖付加には用いることが出来ない。一方、細菌の酵素であるEndo-Aや糸状菌の酵素であるEndo-Mは糖ペプチドや糖タンパク質の合成における糖鎖の付加のツールとして広く用いられている17。通常、Endo-Aはニワトリ卵白から得られる糖ペプチドを供与体基質として、高マンノース型糖鎖を化合物に結合付加させるためのツールとして用いられ、Endo-Mはニワトリ卵黄から抽出した糖ペプチドから複合型糖鎖を化合物に結合付加するために用いられる18。当初はGH85ファミリーに属するENGaseのみが糖転移活性を有すると考えられていたが、GH18ファミリーに属するいくつかのENGaseもまた糖転移活性を有することが見出された。

3. 糖鎖工学のツールとしてのENGaseの糖転移活性の向上

糖鎖工学における糖鎖の付加技術として、ENGaseを用いた酵素法が唯一の効率的かつ実用的な方法であることが認められ、広く受け入れられるようになって来た。ENGaseはGlcNAcを有する化合物（ペプチドまたはタンパク質）へ、オリゴ糖の付加を何らかの保護基を必要とすることなく、一段階で、かつ位置選択的および立体選択的な方法で進めることができる。しかし、ENGaseの糖転移活性は加水分解活性に比べて相対的に低く、生成物はそれほど蓄積されない。主な問題は一旦、得られた糖転移生成物がENGaseの基質として酵素的に再分解されることである。この問題を解決するため、加水分解活性は欠損しているものの糖転移活性は保持している新規なグリコシダーゼ変異体の開発が試みられ、GH85ファミリーに属するEndo-Mの推定される触媒領域の部位特異的変異が行われた。このような変異酵素のひとつであるY217Fはもとの酵素よりもより高い受容体基質への親和性を示し、チロシン残基の水酸基を除くことによって触媒部位への基質の結合が促進されることが示唆された19。同様にいくつかの変異酵素が取得されたが、なお生成物を加水分解することが示されて、糖鎖工学のツールとしては適しなかった。

4. 開発された酵素と修飾された供与体基質を用いたENGaseの触媒反応の向上

糖の加水分解酵素(GH)が触媒する糖転移反応の向上に関する研究は、WithersとPlanasが変異酵素「グリコシンターゼ」としてグリコシダーゼを部位特異的に変異することによって行われている20.21。すなわち、保持機構を持つグリコシダーゼの触媒的求核残基を反応に関与しないアミノ酸残基に置換することで、これらの変異酵素は天然基質とは反対のアノマー配置をもつ活性化供与体 (たとえばフッ化糖) を利用することができるが、反応生成物を加水分解することはできない。これらの知見は、ENGaseが触媒する糖転移反応の促進効果にも寄与した。

糖転移反応は糖加水分解酵素の求核触媒残基と一般酸/塩基触媒残基の２つの活性基によって介される二重置換反応機構（double displacement mechanism）を通じて進行することが知られている22。通常、グリコシダーゼは保持型か反転型のどちらかの機構によって糖の結合を加水分解するが23、どちらの機構にもオキソカルベニウムイオン様の遷移状態と一対のカルボン酸（アスパラギン酸とグルタミン酸残基）が関わっている。しかし、求核触媒残基が欠失していて基質補助機構（substrate-assisted mechanism）を介して作用するいくつかのN-アセチルヘキソサミニダーゼのような例外がある24。この触媒機構は基質の官能基が酵素の触媒作用に寄与する。この場合の求核触媒残基は加水分解を受ける基質のGlcNAc残基の2-アセトアミド基である。いくつかの微生物由来のENGaseは1,2-オキサゾリニウムイオン中間体の形成を介して2-アセトアミド基が関与する基質補助機構を介して作用する25。このようなGH85ファミリーに属するENGaseはオキサゾリニウムイオン中間体を介して加水分解反応と糖転移反応を触媒すると考えられ、他のGH18ファミリーに属する細菌のENGaseの触媒機構はGH18ファミリーに属するキチナーゼやGH20ファミリーに属するN-アセチルヘキソサミニダーゼの機構と類似している11。これらの結果は、オキサゾリン化合物が遷移状態を模倣しており、ENGaseの糖転移反応における供与体基質として糖オキサゾリンを用いることが考えられた。正田らは２糖のオキサゾリン糖がGH85ファミリーに属するいくつかのENGaseに対する活性化糖供与体基質として用いることができることを示した。さらに保護基も必要とせずに複合型のオキサゾリン糖鎖を容易に合成するための簡単な方法を示し25、合成されたオキサゾリン糖鎖はENGaseの糖転移活性の優れた基質となることを明らかにした。この結果から、合成オリゴ糖オキサゾリンを用いた糖ペプチドおよび糖タンパク質の化学-酵素合成の可能性が検討されるようになった。また、この合成オキサゾリン糖はGH18ファミリーに属するENGaseの糖転移反応に対する供与体基質としても有効であることが示された。実際、ENGaseと合成オキサゾリン糖の組合せにより、糖転移反応は通常75～85%の収率で目的の糖ペプチドが生成された。

合成オキサゾリン糖を用いることは糖転移生成物の合成に有効であるが、ENGaseによる生成物の速やかな加水分解のためにその収率はまだ十分ではない。この問題に対する一つの解決策は、生成物に対する加水分解活性は欠くが、オキサゾリン糖を供与体基質として用いることができるENGaseを基盤としたユニークなグライコシンターゼを開発することである26。この目的のために、ENGaseの部位特異的変異が行われ、グライコシンターゼ変異体が作製された。梅川らは糖の活性化供与体としてMan9GlcNAc N-型糖鎖のオキサゾリン体を用いることによって得られたENGase由来の最初のグライコシンターゼを見出した。このEndo-Mの変異酵素は糖オキサゾリニウムイオン中間体の形成を促進する175位のアスパラギン残基にさまざまな変異が導入されたものである。この重要な残基におけるアスパラギン残基のグルタミン残基(N175Q)への変異は加水分解活性を消失させたが、糖転移反応の基質として活性化糖オキサゾリンを用いることができた27。

触媒反応においてオキサゾリニウムイオン中間体の形成を促進する重要な残基の変異に関わるこれらの結果はEndo-A28、 Endo-D29、 Endo-CC30（担子菌 Coprinopsis cinerea由来）などを含むGH85ファミリーに属するENGaseに広げられた。これらの得られたグライコシンターゼは糖ペプチドや糖タンパク質の化学-酵素合成に有用なものになっている。さらに、Endo-Sが糖転移活性を有することが示され31、そのグライコシンターゼ変異酵素（D233AとD233Q）が作成された32。これらの変異酵素はとりわけFc抗体の糖鎖に対して特異性があり、GH18ファミリーに属するENGaseのグライコシンターゼ化の最初の例でもある。これらの酵素は、対応する糖オキサゾリンから複合型のN-型糖鎖を、糖鎖を除去したリツキシマブに転移して、生成物を加水分解することなく、新しい均一なグリコフォームを有する抗体を形成することができ、また、完全なフルサイズの抗体上でFc抗体のグリカンのリモデリングを行うこともできた。さらに、LiらはS. pyogenesの血清型由来でGH18ファミリーに属するENGaseのEndo-S2のグライコシンターゼであるD184M変異体を作成した。得られたグライコシンターゼはFc抗体のグリカンに対してより高い効率とより幅広い基質特異性を示した33。このグライコシンターゼ変異酵素はIgGの糖鎖に対して特異性を有するので、IgGの糖鎖の除去やリモデリングに広く用いられており抗体の糖鎖工学に対する有用なツールとなっている。

他にもいくつかのENGaseのグライコシンターゼ変異酵素に関する報告があるが、将来的には、新規でかつ効率的なグライコシンターゼの発見と供与体基質としての糖オキサゾリンを用いることが、糖タンパク質や糖ペプチドの大規模な酵素合成の開発に不可欠であろう。

5. ENGaseを用いた糖ペプチドと糖タンパク質の化学-酵素合成

ペプチドは化学的に容易に合成することができるが、糖ペプチドを化学的に合成することはオリゴ糖の化学合成に複雑な段階が含まれることのみならず、N-型糖鎖のペプチドへの付加が難しいことにより、比較的に困難である。そこで、化学-酵素合成法を用いることが、このような問題を解決する最良の方法である。糖ペプチドの最も一般的な化学-酵素合成は、N-アセチルグルコサミニルペプチドの化学合成と、それに続くENGaseを用いたN-型糖鎖の酵素的な転移付加である。ペプチド合成に関しては、まず、ペプチド合成法のFmoc法によりN-アセチルグルコサミニルペプチドを合成する。Fmoc-アミノ酸を材料として、Fmoc-Asnの代わりにFmoc-Asn-GlcNAcをビルディングブロックとして用いる。最終的に、N-アセチルグルコサミニルペプチドと糖供与体の天然糖鎖を用いて、ENGaseの糖転移反応によって糖ペプチドを合成する。この典型的な化学-酵素合成法を用いることにより、Endo-Mを用いて数多くの生物学的に興味深い糖ペプチドが合成されている。それらには糖を付加したペプチドT34やカルシトニン35、グルカゴン36などが含まれる。この合成法はペプチドのグルタミン残基への糖の付加も可能である。ペプチドのグルタミン残基へ生物学的に糖鎖を付加することは不可能であるが、Fmoc-Glnに代わってFmoc-Gln-GlcNAcをビルディングブロックとして用いたこの化学-酵素合成法によって「グルタミン結合型糖鎖」を有する糖ペプチドを合成することができる。糖鎖を付加したサブスタンスP37や酵母のα-結合因子38などがこの方法によって合成されている。これらの糖鎖を付加したペプチドはもとのペプチドよりもプロテアーゼによる消化や熱処理に対して安定である。Endo-Mを用いたこの化学-酵素合成法はまた多価の糖ポリマー39や糖を付加したインスリン40の合成にも応用されている。さらに、HIV-1エンベロープ糖タンパク質のC-末端ドメインのフラグメントで強力な抗HIV活性を有するC34糖ペプチドもEndo-Aの糖転移活性を用いて合成されている41。また、この化学-酵素合成法により均一なCD52抗原が調製された42。

種々の方法によってGlcNAcを含むペプチドが合成されるに伴い、N‐グリカンのオキサゾリン糖を供与体として用いたENGaseのグライコシンターゼ変異酵素による多くの糖ペプチドが合成されるようになった。これらには、HIVのエンベロープのフラグメントの糖ペプチドやペプチドベースの抗糖尿病薬であるプラムリンチドのグリコシル化変異体などが含まれる43。

天然のタンパク質とENGaseが触媒するグリコシル化反応を用いた糖タンパク質の合成に関して、北条らはEndo-M‐N175Qグライコシンターゼの糖転移活性を用いて、合成したオキサゾリン糖を供与体基質とし、合成したタンパク質に結合させて疎水性糖タンパク質であるサポシンCを化学-酵素的に合成した44。本研究は、構造および機能の研究のための糖タンパク質を構築する化学‐酵素的アプローチの実現の可能性を示すものである。

6. ENGaseの触媒反応を用いた糖タンパク質糖鎖のリモデリング

天然に存在する糖タンパク質は、その糖鎖部分が高度の不均一性を有している。糖タンパク質のグリコシル化の多様なパターンは、生物学的および医薬品開発の応用を困難にし、またその機能理解を妨げる可能性がある。組換えの治療用糖タンパク質の多くは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞による過剰生産によって作られているが、これらの組換え糖タンパク質は糖鎖の構造だけが異なる同一のタンパク質として生産される。それ故に、均一な糖タンパク質を供与できる方法が必要であることは明らかである。このような方法に関連して、ENGaseの加水分解と糖転移の両方の活性を利用することにより、糖タンパク質のN-型糖鎖の酵素的なリモデリングが試みられている。例えば、ウシRNase Bは5から9個のマンノース残基を有する単一の高マンノース型糖鎖を含むが、梅川らは、合成したシアリル複合型オキサゾリン糖鎖とEndo-M-N175Qグライコシンターゼが触媒する糖転移反応との組み合わせを介して、Endo-Hにより不均一なN-型糖鎖を除去したGlcNAcを含むRNase Bにシアリル複合型糖鎖を導入した45。得られた生成物のRNase Bは均一なシアロ糖タンパク質であった。これは、高マンノース型糖鎖を持つ天然の糖タンパク質を、シアロ複合型糖鎖を有するタンパク質にする典型的なリモデリングの例となる。ENGaseの活性を伴うこの方法を用いることによって、組換え酵母の系で産生される組換え糖タンパク質または糖ペプチドの巨大な高マンノース型糖鎖を、ヒトの系に適合し、微生物によって合成されないシアロ複合型オリゴ糖にリモデリングすることができた。このリモデリング戦略は、主に組換え酵母の系によって生産される種々のバイオ医薬品の生産に用いることができる。

最近、酵素補充療法が大きな注目を集めている。グリカンのリモデリングは酵素補充療法の調製に重要な方法である。加水分解酵素が豊富なリソソームへのタンパク質の輸送は、マンノース-6-リン酸（Man-6-P）残基を含む高マンノース型糖鎖を認識する細胞表面のマンノース-6-リン酸受容体46に依存していることは良く知られている。それ故に、オリゴ糖のリン酸化したマンノース残基を有する糖タンパク質の生産は、リソソーム病の治療のための酵素補充療法を改善するために重要である。リン酸化されたN-型糖鎖を有する酵母を利用した酵素補充療法の開発は以前から進められていたが47,48、新たな手段としてENGaseによるトランスグリコシレーションによりリン酸化糖鎖を有する酵素の開発が検討された。Priyankaらは、ENGaseの糖転移活性を用いたリン酸化糖タンパク質の初めての生産を報告した。Man-6-P残基を有する合成四糖をオキサゾリンに変換し、Endo-Aによって糖鎖を除いたRNase Bに転移させて、対応するリン酸化した糖タンパク質を生成した49。また山口らは、脱糖鎖したRNase BのENGaseによる触媒を介したグリカンのリモデリングによってMan-6-Pを含むリン酸化糖タンパク質の合成を報告している50。Zhangらは、短くしたMan-6-P-グリカンオキサゾリンを化学的に合成し、グリコーゲンを分解するリソソーム酵素の欠損によって引き起こされる疾患のポンペ病の治療に用いられる組換えヒト酸性α-グルコシダーゼ (rhGAA) のENGaseを触媒として介したグリカンのリモデリングに用いた51。Endo-F3によってリモデリングされたrhGAAは完全な酵素活性を維持し、受容体に対する結合親和性が20倍増強した。最近、篠田らは組換えカイコを利用しα-L-イズロニダーゼを生産し、この糖鎖を化学合成したリン酸化糖鎖に置き換えることにより、ムコ多糖症Iのニホンザルの臨床症状を改善する結果を示した52。このリモデリング法は糖鎖工学においてますます有用なツールとなるであろう。

7. ENGaseを用いた IgG 抗体の糖鎖工学

モノクローナル抗体（mAbs）は、がん、炎症性疾患、および感染症の治療に用いられる有効な治療用糖タンパク質である53。ほとんどの治療用mAbはIgGクラスに属し、N-結合型糖鎖を有する。典型的なIgG抗体は2本の重鎖と2本の軽鎖から構成されており、2つの同一なFabドメインと1つのFcドメインという3つの主要な領域を形成している54。Fcドメインは重鎖のホモ二量体であり、Asn-297 の位置に保存された N-結合型糖鎖を持ち、この糖鎖は通常、二分岐型の複合型糖鎖である55。Fcドメインは免疫細胞表面の Fc 受容体（FcγR）に結合することで免疫細胞を動員し、抗原を提示している標的に対して食作用、免疫細胞の活性化、サイトカインの分泌などの免疫応答を直接的に引き起こす。Fcドメインの糖鎖修飾はFcγRとの相互作用を介して抗体依存性のエフェクター機能を制御する。これには、ナチュラルキラー細胞を活性化してがん細胞を溶解させる抗体依存性細胞傷害（ADCC）や、補体系を活性化して標的細胞を溶解させる補体依存性細胞傷害（CDC）が含まれる。従って、糖鎖修飾は抗体の生物学的機能や治療効果に深く関わっている。例えば、Fcドメインの N-結合型糖鎖におけるコア部分のフコシル化は、IgG 抗体が細胞の Fc 受容体に結合するのを妨げるため、コアフコースを欠くN-結合型糖鎖は ADCC を著しく増強する56。また、FcのN-結合型糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基はIgGの ADCC と CDC をともに促進することが知られている57。さらに、FcのN-結合型糖鎖の末端に存在するシアル酸残基は、静脈内投与のIgGの抗炎症活性に重要であることが報告されている58。

IgGのFcドメインに付加される N-結合型糖鎖の構造は一般的に不均一であるため、機能的なN-結合型糖鎖を持つ均一なIgGを設計することで、抗体の有効性が向上できる可能性がある。通常、CHO 細胞などの哺乳類の細胞株を宿主として用いて抗体が生産されるが、天然の抗体も組換え体の抗体も多様な糖鎖構造を持つ糖タンパク質として得られる。これらの事実を考慮すると、FcのN-結合型糖鎖についての糖鎖工学はIgG抗体の機能向上に有用なアプローチと考えられる。従って、構造が明らかなN-結合型糖鎖を有するIgGを開発することは必要であり、ENGaseを用いた酵素化学的なN-型糖鎖のリモデリングが注目を集めている。このような背景の下で、Weiらは、酵母Pichia pastoris で発現させたFcドメインにENGaseを用いて脱糖鎖と再糖鎖付加を行い、ヒトIgGの組換えFcドメインの糖鎖リモデリングが可能であることを示した59。まず、組換え酵母で生産された Fcドメインはマンノースのオリゴマーを含む不均一な糖鎖構造を有しており、これをEndo-H により除去して GlcNAc-Fcドメインを得る。次に、Endo-Aを用いて高マンノース型糖鎖をGlcNAc部位に転移させ、均一な糖鎖構造を持つ Fcドメインを得た。さらに、Goodfellowらは、Endo-Sがフコースの有無にかかわらず IgG Fcドメイン上のN-結合型複合型糖鎖に対して高い加水分解および転移活性を持つことを報告した31。S. pyogenes 由来のEndo-S および S. pyogenes 血清型M49由来のEndo-S2は、IgGのAsn-297に付加したN-結合型糖鎖に対して非常に高い特異性を示すため、IgG抗体の糖鎖工学に理想的なツールである。特にEndo-S2は、FcドメインのN-結合型の二分岐複合型糖鎖に特異性を有するEndo-Sよりも広範な基質特異性を有し60、主要な Fcの N-結合型糖鎖のほぼすべてを脱糖鎖する能力を持っている。

Huangらは、Endo-Sのグライコシンターゼ変異体がN-結合複合型糖鎖を、対応する糖オキサゾリンから脱糖鎖したリツキシマブへ転移し、生成物の加水分解を伴わずに新規で均一な糖鎖構造を持つ抗体を作製できることを示した32。また、この方法は完全にフルサイズの抗体のFcのグリカンにもリモデリングが可能であった。この方法は以下の2段階から成る：（１）Endo-SによってIgGの天然の糖鎖を切除し、糖鎖内部のFucα1,6GlcNAc 二糖またはフコースを持たないGlcNAc単糖のみが残されて脱糖鎖されたIgGを得る。（２）化学合成したN-型糖鎖の糖オキサゾリン体をEndo-S変異体（D233AおよびD233Q）が触媒する糖転移反応によって、上記のFucα1,6GlcNAc-IgGまたはGlcNAc-IgGへ転移し、正確なN-型糖鎖構造を持つ糖鎖改変抗体を得る。上記のEndo-Sの変異体を用いたIgGのN-型糖鎖の効率的な糖鎖リモデリングのための化学-酵素的な手法は広く応用されている。LinらはEndo-Sおよびその変異体を用いてFcの糖鎖のリモデリングを行い、抗体の一連の糖鎖構造に改変した結果、末端にα-2,6 結合したシアル酸を2つ持つ二分岐型N-結合糖鎖がADCC、CDC、および抗炎症活性を最適化する構造であることを見出した61。一方、Endo-S2 グライコシンターゼ変異体を用いて、リツキシマブおよびハーセプチンの２つの単クローン抗体のN-結合型糖鎖を効率的にリモデリングできることが例証されている62。これらの結果はバイオ医薬品である単クローン抗体の完全体におけるリモデリングの研究をさらに促進させた。リツキシマブは、しばしばFcのN-結合型糖鎖のリモデリングに用いられ、標的はCD20であり、そのFcドメインに付加しているほとんどの N-結合型糖鎖のコアがフコシル化されていることが知られている。Endo-S2変異体によるリツキシマブのリモデリングでは、コアのフコシル化がエフェクター機能に悪影響を与えることが示されている63。ハーセプチンは乳がんの治療に広く用いられる治療用単クローン抗体で、乳がん細胞のHER2受容体に結合してADCCを誘導し、腫瘍細胞を溶解する。ハーセプチンのFcのN-結合型糖鎖のリモデリングでは、まず Endo-S2とLactobacillus casei由来のα-1,6-フコシダーゼを用いてGlcNAc-Herceptinを得た後、目的糖鎖のオキサゾリン体を供与体基質とし、Endo-S2-D184M グライコシンターゼを用いてフコースを含まないシアル化二分岐複合型糖鎖にリモデリングした64。このフコースを持たないハーセプチンはADCC活性が増強されることが示された。黒河内らは、Endo-S-D233Q変異体およびさまざまなENGase 由来の他のグライコシンターゼ変異体を用いて、トランスジェニックカイコで生産されたフルサイズおよび短くしたFcからなるハーセプチンについて、様々なN-結合型糖鎖構造を含む比較的大きなライブラリーを構築した65。それらを用いて、Fc受容体への結合を評価し、細胞ベースでのアッセイを行った。その結果、糖鎖構造がADCCに影響することを明らかにし、コアフコースが存在するとシアル化がADCCを著しく低下させるが、コアフコースがない場合にはシアル化がADCCに影響しないことを明らかにした。これらの結果は抗体のN-結合型糖鎖のリモデリングに対する糖鎖工学の視野を広げた。Giddensらはさまざまな癌の治療に使われている医療用モノクローナル抗体のセツキシマブのFc（重鎖のAsn-297に結合している）とFab（重鎖のAsn-88に結合している）の両方のN-結合型糖鎖の部位選択的リモデリングを報告している66。この研究はコアがフコシル化しているGlcNAc残基のみに作用し、フコシル化していないGlcNAc残基には糖鎖を付加できないというEndo-F3-D165Aグライコシンターゼ変異酵素の高度な選択性と、IgGのAsn-297のGlcNAc残基のみに糖鎖を付加するEndo-S-D233Aグライコシンターゼ変異酵素を用いて行なったものである。糖鎖改変されたセツキシマブはFc受容体に対する親和性が増加し、ADCC活性が非常に増大した。

さらに、リモデリングした抗体の大規模な生産を目指した研究も進められている。岩本らは、Endo-S（D233Q）および Endo-M（N175Q）の変異体を組み合わせ、糖オキサゾリンを用いずに天然のシアロ糖ペプチドを供与体基質として効率的なワンポットで糖転移反応を行う方法を開発した67。Tangらも同様に、Endo-Mによる糖ペプチドの切断とシアロ糖ペプチドを糖鎖供与体として用いたEndo-S-D233Qによる糖鎖の付加を組み合わせたIgGのN-型糖鎖のリモデリングについてのワンポット法を報告している68。また、化学-酵素法による抗体の糖鎖リモデリングのために、微生物由来の組換えトランスグルタミナーゼを利用した固定化Endo-S2およびそのグライコシンターゼであるD184M変異体の固定化が開発されている69。さらに、Liu らは酵母細胞で発現させたハーセプチンの糖鎖工学に関する興味深い研究を報告しており、発現した組換え抗体のリモデリングを行っている。すなわち、遺伝子改変したPichia pastoris によりポリマンノース糖鎖を持つ抗体の作製を行い、これを Endo-H または Endo-E（Enterococcus faecalis由来）で糖鎖を除いた後、Endo-S2-D184M を用いて糖鎖を付加して、組換え抗体の糖鎖をリモデリングした。この方法は、望ましい糖鎖構造を持つ抗体を大規模に生産できることを示唆している70。

8. 展望

糖鎖の構築における酵素の利用は、酵素反応が穏やかな条件下（常温・中性条件など）で進行できることに加え、酵素の基質特異性が非常に高い位置選択性を示すために糖鎖工学においてより有用である。さらに、遺伝子工学やタンパク質工学などのさまざまな技術を用いることで、酵素の特異性を改変することが可能になり、より広範な基質に対して活性を示す酵素を設計することができる。ENGaseを利用した糖鎖のリモデリング技術は、モノクローナル抗体などの組換えバイオ医薬品を大規模に生産することを可能にする手法として期待される。将来的には、化学-酵素合成法に基づいた効率的で自動化された糖鎖合成プロセスが開発され、糖鎖の精密な調製がより容易になると予想される。このような化学酵素合成法の効果的な応用は、糖鎖科学の新たな展開につながるであろう。

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