Feb 03, 2025

希少糖生産酵素
（Glycoforum. 2025 Vol.28 (1), A2）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.28A2J

吉原 明秀 / 吉田 裕美 / 望月　進 / 加藤 志郎

吉原 明秀

氏名：吉原 明秀
香川大学国際希少糖研究機構 機構長補佐、香川大学農学部 准教授
2004年香川大学農学部生物資源化学科卒業、2006年香川大学大学院農学研究科修了、2009年愛媛大学連合農学研究科修了（農学博士）、2009年香川大学希少糖研究センター助教、2017年香川大学国際希少糖研究教育機構・農学部准教授、現在に至る。
専門は酵素利用学・微生物利用学。微生物や酵素を用いて新規な希少糖を生産することを研究テーマとしており、酵素の力と希少糖のもつ可能性に魅力を感じている。

吉田 裕美

氏名：吉田 裕美
香川大学国際希少糖研究機構 准教授、香川大学医学部 准教授
1994年東京農工大学工学部物質生物工学科卒業、1996年東京農工大学工学研究科修了、1999年東京農工大学工学研究科物質生物工学専攻修了（博士（工学））、1999年東京農工大学工学部助手、2001年海洋バイオテクノロジー研究所NEDO養成技術者、2002－2004年University of Groningen 博士研究員、2004年香川大学総合情報基盤センター助教授、2007年香川大学総合生命科学研究センター准教授、現在に至る。
専門は、タンパク質工学、構造生物化学。希少糖生産関連酵素の構造解析を通して、希少糖生産チームの仲間と希少糖の研究を楽しんでいる。

望月 進

氏名：望月　進
香川大学国際希少糖研究機構 准教授、香川大学農学部 准教授
1999年広島大学工学部第三類（化学系）卒業、2001年同大学大学院先端物質科学研究科博士課程前期修了、2001～2005年理化学研究所植物科学研究センターテクニカルスタッフ、2005～2008年日本学術振興会特別研究員（DC1）、2008年広島大学大学院先端物質科学研究科博士課程後期修了博士（理学）取得、2008～2014年農業生物資源研究所博士研究員、2014～2016年香川大学農学部博士研究員、2016年香川大学国際希少糖研究教育機構助教、2021年香川大学国際希少糖研究教育機構・香川大学農学部准教授、現在に至る。
専門分野は微生物・植物のゲノム科学と分子細胞生物学。希少糖という自然界の希少化合物の生産と作用を担う希少糖生産遺伝子・希少糖代謝遺伝子とも言える微生物や植物の「汎用遺伝子」を調べることで、希少糖の実用化に貢献したい。

加藤 志郎

氏名：加藤 志郎
香川大学国際希少糖研究機構 准教授、香川大学農学部 准教授
2004年名古屋大学農学部応用生物科学科卒業、2006年名古屋大学大学院生命農学研究科博士課程（前期課程）修了、2009年名古屋大学大学院生命農学研究科博士課程（後期課程）単位取得退学、2010年博士（農学）取得、2009年名古屋大学大学院生命農学研究科研究員、2013年関西大学先端科学技術推進機構ポストドクトラルフェロー、2016年香川大学国際希少糖研究教育機構助教、2021年香川大学国際希少糖研究教育機構・香川大学農学部准教授、現在に至る。
専門分野は生化学・微生物学。新奇な酵素との出会いを求めて希少糖代謝に関与し得る酵素の探索と機能解析に臨んでいる。

序文

希少糖を紹介する本シリーズの第2話では、希少糖は様々な酵素（アルドースイソメラーゼ、ケトース3-エピメラーゼ、ポリオールデヒドロゲナーゼなど）を利用して生産できることが示され、さらにそれらの反応を組み合わせることで、炭素数６のヘキソースの網羅的な生産方法である希少糖の生産戦略図であるイズモリングが紹介された。今回は、希少糖を生産するための酵素の中でも自然界に多量に存在するD-フルクトース（果糖）から希少糖D-アルロース（=D-プシコース）の生産に利用できるケトース３-エピメラーゼおよび生産したD-アルロースから希少糖D-アロースを生産できるL-ラムノースイソメラーゼについて紹介する。本来、自然界での存在量が少ない希少糖を作り出す、「希少糖生産酵素」というものは存在しない。しかし、希少糖に変換できる酵素というものは自然界に存在する。ここでは、その中でも希少糖の生産に利用することができた微生物由来の酵素の特徴を概説する。

1. 希少糖D-アルロースを生産できる酵素の発見

第２話で紹介したように新規酵素D-タガトース 3-エピメラーゼは、炭素数が５のケトペントースや炭素数６のケトヘキソースのC3位の水酸基のエピ化反応を触媒できる。本酵素は、1991年に土壌よりスクリーニングしたPseudomonas cichorii ST-24株（P. cichorii ST-24）が生産する酵素で、本菌株を用いてガラクチトールから希少糖を作る過程で発見された。基質にガラクチトールを用いて、本菌株による菌体反応を行った結果、未知の生産物の蓄積が確認された。生産物の同定を行った結果、本菌株はガラクチトールから中間産物としてD-タガトースへ酸化し、その後最終産物であるD-ソルボースに転換していることが明らかとなった1,2。さらなる検討を重ねた結果、D-タガトースからD-ソルボースへの転換反応には、P. cichorii ST-24が生産するケトース3-エピメラーゼが関与することが明らかとなった。さらに本酵素を精製し、酵素学的諸性質を検討した結果、D-タガトースに対する反応性が最も高いことよりD-タガトース 3-エピメラーゼ（D-TE）と命名され、さらにD-TEがケトペントースとケトヘキソースのC3位の水酸基の可逆的なエピ化反応を触媒出来ることが明らかとなった2（Fig. 1）。そのため本酵素を用いて様々な希少糖が生産できるようになり、ひいては希少糖生産戦略図であるイズモリングの考案にもつながった3。

図1
Fig. 1. P. cichorii D-TEの酵素反応
P. cichorii D-TE は(a)の異性化反応だけではなく、(b)の異性化反応も行うことができる。 D-fructose から D-allulose を生産することが可能。

2. 希少糖D-アルロースの生産

P. cichorii ST-24由来のD-TEがすべてのケトペントースやケトヘキソースに作用できることが明らかになり、大量生産が可能になった希少糖がD-アルロースである。D-アルロースは自然界に多量に存在するD-フルクトース（果糖）のC3エピマーであり、D-フルクトースにD-TEを作用させることで、D-フルクトースからD-アルロースへ約25%転換できることが明らかとなり、大量のD-アルロースの生産が可能となった。反応後平衡に達したD-フルクトース：D-アルロース＝75：25の反応液からのD-アルロースの分離精製には、当初パン酵母を用いた資化反応によってD-フルクトースを除去する方法が取られてきたが、2000年頃に擬似移動式クロマト分離装置を導入することによって、純粋なD-アルロースの生産量を向上することができた4。また、D-アルロースを大量に作ることが出来るようになると、生産したD-アルロースを基質に用いて、新しい希少糖の生産へと展開していった。

3. P. cichorii 由来D-タガトース 3-エピメラーゼの構造と触媒反応機構

D-アルロース生産ができるD-TEのX線結晶解析が行われ、D-TEはTIMバレル構造を持つサブユニットがホモ二量体を形成していることが示された（Fig. 2 (a), Fig. 3）5。基質複合体構造のX線結晶解析から、D-TEの触媒反応機構については、cis-エンジオレート中間体を経る反応機構が支持されている。基質としてD-フルクトースが結合した活性部位では、二価の金属イオンが2つの触媒残基（Glu152とGlu246）を含むアミノ酸残基と、D-フルクトースの2位のカルボニル酸素と3位の水酸基と配位結合を形成していた。2つの触媒残基は基質を挟み込むように存在し、Glu246が基質のC3位からプロトンを引き抜くことによってcis-エンジオレートの中間体が形成され、続いて基質のO3位のプロトンがGlu152引き抜かれる。同時に、Glu246から基質のO3にプロトンが移動し、Glu152がC3位にプロトンを与える。この反応機構では、可逆的な反応が行われる触媒残基のGluは常にイオン化されていることになり、C3とO3のプロトンが交換されていることから、C3-O3プロトン交換機構として提唱している（Fig. 2 (b)）5。また、本来の基質であるD-タガトースが結合した基質複合体構造においても、D-フルクトースが結合した時と同様に、金属イオンと結合し、触媒反応が関与する基質の2位と3位、1位は酵素により強固に認識されていたが、4位と5位の基質認識は甘いことがわかった。これは、D-TEはD-タガトースだけではなく全てのケトヘキソースやケトペントースも基質とすることができる基質特異性の広い酵素であることを支持する結果であり、D-TEがイズモリングの作成を導いた酵素であったこと、D-フルクトースを基質としてD-アルロースを生産できる希少糖生産酵素の基幹酵素となったこととつながった。

図2
Fig. 2. P. cichorii D-TEの構造と触媒反応機構

4. その他のケトース 3-エピメラーゼ

P. cichorii 由来のD-TEは、自然界に大量に存在するD-フルクトースから希少糖D-アルロースを生産するイズモリングの入り口となる希少糖生産の基盤酵素となり、ケトース3‐エピメラーゼの第1ファミリーとして位置づけられるようになった。その後、D-TEの類似酵素としてD-アルロースに対してより高い活性を示すD-アルロース 3-エピメラーゼ （D-AE）が、ケトース3‐エピメラーゼの第2ファミリーとして見出され、様々な微生物由来（Agrobacterium tumefaciens6; Clostridium bolteae7; Clostridium cellullyticum8; Dorea sp.9; Ruminococcus sp.10; Treponema primitia11など）のD-AEが次々と報告された。D-TEや初期の頃に報告されたD-AEは、比較的熱安定性が低いものが多く、より熱安定性の高い酵素がスクリーニングされていき、熱安定性が高くD-アルロースに対しても高い酵素活性を示すケトース3‐エピメラーゼの第3ファミリーであるL-リブロース 3-エピメラーゼも、D-フルクトースからD-アルロース生産が可能なケトース3‐エピメラーゼとして報告されている（Arthrobacter globiformis12,13; Methylomonas sp.14; Labedella endophytica15）。D-AEについては多くの微生物由来のD-AEが報告され続け、近年では、安定性の高いD-AE (DaeM from metagenomic DNA16; Pirellula sp.17; Arthrobacter psychrolactophilus18; Clostridia bacterium19; Thermogutta terrifontis20）や、酵素改良を行ったD-AE（Dorea sp.21; Clostridium bolteae22; Halanaerobium congolense23; Agrobacterium sp.24）も報告されている。これらのケトース3‐エピメラーゼは、基質特異性は異なるものの、ホモ二量体もしくはホモ四量体を形成し、サブユニット構造はTIMバレル構造を形成している（Fig. 3）。これらの構造は良く似ており、触媒残基を含めた主要な活性部位のアミノ酸残基もよく保存されている。

図3
Fig. 3. ケトース 3-エピメラーゼファミリーの構造

先に述べたように、ケトース 3-エピメラーゼの中でも、D-アルロースに対する特性が重視され、近年のD-アルロース生産に用いられる酵素はD-AEが中心となっている。結晶構造が決定されているケトース 3-エピメラーゼファミリーに属する酵素については構造解析が詳細に報告され（A. tumefaciens D-プシコース 3-エピメラーゼ（AtDPE）25; Pseudomonas cichorii D-TE（PcDTE）5; C. cellulolyticum D-PE（CcDPE）26; Pseudomonas cichorii D-TE C66S（PcDTEC66S）27; Arthrobacter globiformis D-AE（AgDAE）13; Methylomonas sp.由来 L-リブロース 3-エピメラーゼ（MetLRE)14; Clostridia bacterium 由来D-AE（CloDAE)28; Sinorhizobium fredii D-AE（SfDAE）29; Agrobacterium sp. D-AE24; Kroppenstedtia eburnean D-TE（KeDTE）30）、これらのケトース 3-エピメラーゼの酵素特性のさらなる改良も期待される。

5. D-アロースの生産に用いる酵素　L-ラムノースイソメラーゼ

D-アルロースの大量生産が可能になったことで、得られたD-アルロースを出発物質として、新たな希少糖生産を行うことができる。その一つが、イズモリングにあるD-アルロースからD-アロースへの変換であり、L-ラムノースイソメラーゼ (L-RhI)を用いたD-アロースの生産である。E. coliをはじめ、様々な微生物由来のL-RhIはL-ラムノースとL-ラムニュロース間の異性化反応を触媒することは報告されていたが、Pseudomons sp. LL172株由来のL-RhI（後のPseudomonas stutzeri 由来L-RhI: PsL-RhI）は、D-アルロースからD-アロースを生産できることが何森らによって報告された31（Fig. 4）。Pseudomons sp. LL172は土壌中より単離された微生物であり、L-ラムノース存在下で誘導的にL-RhIを生産する。本菌株を代謝できないL-リキソース存在下で振盪培養することで、L-リキソース代謝変異株の獲得にも成功しており、本変異株が、構成的にL-RhIを発現することが明らかとされた。また、PsL-RhI を各種カラムクロマトグラフィーにより精製して酵素学的諸性質を検討した結果、PsL-RhI はL-ラムノースだけでなく、L-リキソース、L-マンノース、D-グロース、D-リボース、D-アロース、L-タロースに対して反応できる基質特異性の広い酵素であることが明らかとなった。さらにPsL-RhIを用いてD-アロースの大量生産にも着手しており、擬似移動クロマト分離装置を用いることで、D-アルロースからのD-アロースの大量生産にも成功している。

図4
Fig. 4. P. stutzeri L-RhI の酵素反応
P. stutzeri L-RhI は (a) の異性化反応だけではなく、(b) の異性化反応も行うことができる。 D-allulose から D-alloseを生産することが可能

6. P. stutzeri 由来L-ラムノースイソメラーゼの構造と触媒反応機構

L-RhIの構造は、KorndörferらによってE. coli 由来のL-RhI (EcL-RhI)の構造が初めて報告され32、その触媒反応機構についても解明された。その後、希少糖生産に用いられるPsL-RhIのX線結晶解析が行われ、希少糖との複合体構造も報告された33。EcL-RhIと同様に、PsL-RhIもTIMバレル構造を持つサブユニットがホモ四量体を形成し（Fig. 5 (a)）、活性部位には、2つの金属イオン（M1とM2）が結合していた（Fig. 5 (b)）。これらの2つの金属イオンは、基質との結合を安定化させるstructural metal (M1)と触媒反応に寄与するcatalytic metal (M2)として知られている。基質のO1、O2、O3は金属イオンと配位結合をするとともに、酵素によっても厳密に認識されている。L-RhIの触媒反応機構は、catalytic waterが関与して基質の1位と2位の間でアルドースとケトースの異性化反応が起こるhydride-shift機構が支持されている。基質の1位と2位の近傍に酸-塩基触媒として働くアミノ酸残基がなく、金属イオンにより活性化された水分子（ヒドロキシアニオン）が酸-塩基触媒として働き、1位と2位の間で水素アニオンが移動することによって異性化が起こると考えられる。

図5
Fig. 5. P. stutzeri L-RhIの構造と触媒反応機構

PsL-RhIでは、幅広い基質特異性が確認され、基質特異性の観点からD-キシロースイソメラーゼとの関連性も報告されている34。PsL-RhIとEcL-RhIの全体構造はよく似ているが、両者には活性部位の形成に関与するフレキシブルなループ領域が存在している（Fig. 6）。単量体構造で赤く示されているループ領域は二量体ユニットの界面においてその違いが顕著に現れている。EcL-RhIのループ領域は自身のサブユニット構造内の活性部位を形成しているが、PsL-RhIでは隣接するサブユニットの活性部位を形成に関わっている。このような入れ子構造になって活性部位を形成している構造は、D-キシロースイソメラーゼでも見られている特徴であり、基質特性のみならず、構造の面でもD-キシロースイソメラーゼとの関連性も確認された33。

図6
Fig. 6. E. coli L-RhIとP. stutzeri L-RhI

これまでに、Bacillus halodurans由来のL-RhI35やLactobacillus rhamnosus由来のL-RhI36の構造が報告されているが、B. halodurans由来L-RhIの該当ループ領域は揺らいでいるため見えておらず、L. rhamnosus由来L-RhIはEcL-RhIと同じタイプの二量体ユニットを形成していた。近年の系統樹解析においても、PsL-RhIはEcL-RhIよりD-キシロースイソメラーゼに近いL-RhIであることが示され37、希少糖生産酵素として見出されたPsL-RhIの基質認識の広さを改めて確認することができる。

7. まとめ

希少糖シリーズの第4話となる本稿では、希少糖生産の基盤酵素であるケトース3-エピメラーゼおよびL-ラムノースイソメラーゼの構造と触媒反応機構について解説した。これらの内容は、希少糖生産に関する基礎的知見であるとともに、大量生産に繋がる重要な分岐点となった研究成果である。本稿に続く第5話からは、希少糖の用途開発を産学官で協力して進めている現状について紹介される。世界各国で食品用途のみではなく、様々な産業への展開が可能な希少糖の機能性が明らかになるにつれ、各種の希少糖へのニーズが高まり、効率の良い希少糖生産方法や生産酵素に関する研究も競争が激化してきている。その中で、各種の希少糖が生産可能な基質特性の広い酵素や、環境耐性が強く生産性の高い高効率な酵素が様々なグループから報告されてきており、それらの構造に関する知見を基に部位特異的なアミノ酸変異を加えた遺伝子組換え酵素の作出や、新たな希少糖生産酵素をもつ微生物を探索も進んでいる。新たな希少糖生産酵素や希少糖生産酵素を持つ微生物の獲得が、様々な希少糖の大量生産に繋がり、希少糖を用いた応用研究が進むことで、希少糖の新たな機能性が発見・解明され、その成果が社会に還元されることを期待している。

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