Oct 01, 2024

tRNAの糖付加修飾と生理機能
（Glycoforum. 2023 Vol.27 (5), A21）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.27A21J

鈴木　勉

鈴木　勉

氏名：鈴木　勉
東京大学大学院工学系研究科化学生命工学専攻・教授
バイオエンジニアリング専攻、東京大学定量生命科学研究所を兼務
1996年東京工業大学大学院生命理工学研究科博士課程修了、三菱化学横浜総合研究所勤務、東京大学助手、講師を経て、2004年現所属助教授就任、2008年に教授に昇任。2020年よりJST-ERATO鈴木RNA修飾生命機能プロジェクト研究総括に就任。生命現象の分子的側面を炙り出すことをモットーに研究を行っている。平日はプールで1マイル泳ぐことが日課。

1. はじめに

タンパク質合成のアダプター分子であるtRNAにはさまざまな化学修飾が含まれており、これらはtRNAの機能に重要な役割を担っている。キューオシン(Q)は7-デアザグアノシン骨格およびシクロペンテン環を持つことが特徴であり、バクテリアおよび真核生物に広く存在するtRNA修飾である。ヒトや脊椎動物のtRNAには、Qにガラクトースが付加したガラクトシルQ (galQ)と、マンノースが付加したマンノシルQ (manQ)が存在する。これらの糖付加Q修飾の機能は、その発見から約半世紀もの間、不明なままであったが、最近私たちはgalQとmanQの形成を担う糖転移酵素を同定し、糖付加Q修飾の生合成、タンパク質合成における機能、さらには生理的な役割を解明した。

2. RNA修飾の世界

RNAは転写後に様々な修飾を受けて成熟しさまざまな機能を獲得する。同じ核酸であるDNAには、わずか数種類の修飾塩基が見つかっているに過ぎないが、RNAには、現在までに約150種類にもおよぶRNA修飾が様々な生物種から見つかっている。これらは、塩基やリボースのメチル化、アセチル化、リン酸化、水酸化、脱水環化、硫化、セレノ化、還元、異性化、アミノ酸や糖の付加など、化学的なバリエーションに富んでいる1。多様なRNA 修飾は、生物が進化する過程において、RNAが新たな機能を担うために獲得したものであると考えられる。ここ数年でも、私たちを含むいくつかのグループから新規のRNA修飾が報告されており、RNA 修飾のケミカルスペースは拡大の一途をたどっている2-4。また、RNA修飾の欠損はヒトの疾患の原因になることが明らかにされ、RNA修飾病という疾患の新しい概念が生まれている2,5-7。世界的にもエピトランスクリプトミクス研究は、新しい創薬や治療の標的として注目されており、この分野に特化したプロジェクト研究や創薬ベンチャー企業が乱立しており、産業界からも熱い視線が注がれている。

3. tRNAの糖付加キューオシン修飾

tRNAはタンパク質合成において、mRNA上のコドンをアミノ酸へと変換するアダプター分子である。tRNAは最も複雑に修飾されたRNA分子である。これまでに見つかっているRNA修飾の約8割はtRNAから見つかったものである2。特に、tRNAのアンチコドンの1字目（34位）（図 1A）には様々な修飾が導入されており、tRNAがmRNA上のコドンをリボソームのA部位において、正確かつ効率的に読み取ることを可能にしている。キューオシン(Q)は7デアザプリン骨格およびシクロペンテン環を持ったグアノシンの誘導体であり、バクテリアからヒトに至る多くの生物に見られるユニークなtRNA修飾である（図 1B）。興味深いことに、バクテリアはQの塩基部分であるキューイン（q）を生合成するが、ヒトや脊椎動物はqを自前で生合成することができず、腸内細菌が合成したqや食物から栄養素として摂取したqを腸管から吸収し、tRNAのQ修飾に利用する8（図 1B）。ヒトではQTRT1とQTRT2の複合体がトランスグリコシラーゼの活性を持ち、tRNAのアンチコドン1字目のグアノシンの塩基部分をqに付け替えることで、tRNAにQを導入する。ヒトや脊椎動物は、ヒスチジン（His）、アスパラギン（Asn）、チロシン（Tyr）、アスパラギン酸（Asp）に対応する4種類の細胞質tRNAがQ修飾を持つが、このうち、Tyrに対応するtRNATyrはQにガラクトースが付加されたガラクトシルキューオシン（galQ）に変換され、一方でAspに対応するtRNAAspではQにマンノースが付加されたマンノシルキューオシン（manQ）に変換される（図 1B）。galQやmanQは1976年に西村暹(すすむ)博士らの研究グループによって発見され9、tRNA修飾の中で糖が付与された稀有な修飾体として興味深い研究対象として知られてきたが、その生合成や機能は約半世紀もの間、謎に包まれていた。

図1
図 1. 生物三界におけるRNA修飾の分布
A. tRNAのアンチコドン1字目(34位)にはコドンを解読するために糖付加Q修飾など多彩な修飾が導入される。
B. tRNA上で生じるQ修飾およびその糖付加の生合成

4. tRNA糖転移酵素の発見

糖転移酵素はスーパーファミリーを形成し、ヒトゲノムには230種類の糖転移酵素がコードされている10,11。私たちの研究グループは、まず比較ゲノム法を用いて、機能未知な糖転移酵素から、galQやmanQの修飾酵素の探索を試みたが、徒労に終わっていた。幸い、細胞の抽出液から、UDPガラクトースを用いてtRNAにgalQを導入する活性、およびGDPマンノースを用いてtRNAにmanQを導入する活性を検出することに成功した。そこで酵素活性を指標に生化学的に糖転移酵素を分画した。ラット肝臓の抽出液を、硫安分画と複数のカラムクロマトグラフィーを用いて分画することで、tRNATyrのQ修飾にガラクトースを転移する酵素B3GNTL1を同定することに成功し、キューオシンtRNAガラクトース転移酵素（QTGAL）（図 1B）と命名した12。また、ブタ肝臓の抽出液を分画し、tRNAAspのQ修飾にマンノースを転移する酵素GTDC1を同定し、キューオシンtRNAマンノース転移酵素（QTMAN）（図 1B）と命名した12。

5. 糖転移反応のメカニズム

QTGALとQTMANは、それぞれUDPガラクトースおよびGDPマンノースを糖供与体として、galQとmanQを生合成する。糖転移反応は糖のC1炭素の立体配座がα配座からβ配座へと反転する場合と、α配座のまま保持される場合がある（図 2）｡QTGALは糖転移酵素のGT-Aフォールドを持つGT2ファミリーに属し、Qのシクロペンテン環の11位の水酸基にUDPガラクトースのC1炭素をSN2型の求核置換攻撃させることで、C1炭素の立体配座がβ配座へと反転しgalQが生成する（図 2）。一方で、QTMANはGT-Bフォールドを持つGT4ファミリーに属し、保持型の糖転移反応を触媒することで、Qのシクロペンテン環の12位の水酸基にα配座のままマンノースが転移し、manQを生成する（図 2）。

酵素反応の速度論的な解析から、QTGALのUDPガラクトースに対するミカエリスーメンテン定数（Km値）は14 μMであり、QTMANのGDPマンノースに対するKm値が69 μMと比較的高いことが判明した。細胞内のUDPガラクトースおよびGDPマンノースの濃度はそれぞれ7-65 μM11,13-16および0.9-11μM13と見積もられている。それぞれのKm値が糖供与体の細胞内濃度と同様の値を示していることから、糖付加Q修飾はUDPガラクトースおよびGDPマンノースの細胞内濃度で調節させている可能性が示唆された。

図2
図 2. 糖付加の異なる2つの反応機構

6. 糖付加tRNA修飾の機能

私たちはQTGALとQTMANそれぞれの遺伝子を破壊したヒトの培養細胞（QTGAL KOおよびQTMAN KO）を作成し、これらのKO細胞から精製したtRNAにはgalQおよびmanQがそれぞれ完全に消失することを確認した。次に、理化学研究所の岩崎信太郎研究室と共同で、リボソームプロファイリングを行ったところ、QTGAL KO細胞では、tRNATyrが読むコドンのうちUACコドンの翻訳速度が速くなり、QTMAN KO細胞ではtRNAAspが読むGACとGAUコドンの翻訳速度が速くなることが判明した。Q修飾はリボソームの翻訳速度を速める働きがあることから、Qの糖付加修飾は早すぎる翻訳速度を制御する役割があることがわかった。一般的にtRNA修飾は翻訳速度を促進する働きがあるが、Qの糖付加は翻訳速度を抑制することが判明した初めてのtRNA修飾である。また、tRNATyrは潜在的に終止コドン（UAGとUAA）を読み飛ばすことが知られているが、galQのガラクトース付加修飾に終止コドンの読み飛ばしを防ぐ役割があることも判明した。

一般に、tRNA修飾は適切な翻訳速度の維持に重要な役割を担い、tRNA修飾が欠損すると、新生タンパク質のフォールディングに異常が生じることが知られている17。各KO細胞にレポーター遺伝子を導入し、タンパク質の凝集度を計測したところ、いずれのKO細胞においても凝集したタンパク質が蓄積したことから、糖付加Q修飾は適切な翻訳速度を調節することで、プロテオスタシスの維持に重要な役割を担っていることが判明した。

7. 糖付加Q修飾によるコドン解読の構造基盤

次に私たちは、理化学研究所の白水研究室の支援の下、リボソームとtRNA複合体の構造解析を行った。ヒト細胞から精製したリボソームに修飾状態の異なるtRNAを結合させて、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を行った（図 3AB）。その結果、Q修飾のシクロペンテン環は水素結合を介してコドン―アンチコドン対合が形成する二重らせんの主溝に結合し、主溝結合基（major groove binder）として機能することで、コドン認識の効率を上げていることが明らかとなった（図 3C）。特にこの効果はコドン3字目がUを持つ、UAUやGAUコドンの際に効果が高いことも判明した。一方で、Qの糖付加は、シクロペンテン環を回転させることでこの効果を弱める働きがある（図 3D）ことがわかり、糖付加Q修飾による翻訳調節の分子基盤が明らかとなった。

図3
図 3. 糖付加Q修飾はコドン-アンチコドン対合の主溝に結合する
A.クライオ電子顕微鏡によるヒト80Sリボソーム複合体の構造
B. Aサイトにおけるコドンアンチコドン対合を拡大
C. GAUコドンを認識するQ修飾（左）とmanQ修飾（中）、UAUコドンを認識するgalQ修飾（右）の構造。Qのシクロペンテン環はコドンアンチコドン対合に主溝側から結合し、複数の水素結合を形成するが、糖付加Q修飾は水素結合による認識が見られない。
D. マンノース（左）およびガラクトース（右）の付加はQのシクロペンテン環をそれぞれ160°と170°回転させ、主溝結合能を低下させることで、翻訳速度を制御する。

8. 糖付加Q修飾の生理機能

糖付加Q修飾による生理機能を探求するために、京都産業大学の三嶋雄一郎研究室との共同研究により、ゼブラフィッシュを用いたqtgalおよびqtmanのノックアウト系統の解析を行った。これらの変異体は正常に胚発生したが、野生型と比較して生後の成長速度が顕著に遅く、体長が短いという表現型を示した。さらにqtgal KO系統では、eIF2αのリン酸化が顕著に亢進していることが判明した。これは、適切な翻訳速度が乱れたことにより、タンパク質のフォールディング異常を検知し、統合的ストレス応答が作動していることを示唆している。以上の結果から、糖付加Q修飾はゼブラフィッシュの健全な生育に必要であることが判明した。

Q修飾とヒトの疾患との関係について多くの研究報告がある18。悪性腫瘍やがん細胞においてQ修飾が低下することが報告されている19-21。またQ修飾の低下は各がんのステージと強い相関がある22。さらに、QTRT1の欠損は、がん細胞の増殖を抑制することが知られている23。 TCGAデータベース24によると多くの腫瘍においてQTRT1, QTRT2, QTMAN, QTGALの発現量の増加がみられる。QTRT1が高発現すると腎臓癌の予後が悪く、子宮頸がんでは逆の傾向がある。QTRT2については、発現量が多いほど脳腫瘍の予後が悪い。QTGALが高発現すると腎臓癌の予後が悪くなる。QTMANは発現量が低いと脳腫瘍の予後が悪いが、発現量が高いと肝臓癌の予後が悪い。がん以外の疾患に関しても、GTDC1(QTMAN)の機能障害がグリシン代謝異常を介してNMDA受容体の過剰活性化を引き起こし、神経発達障害の原因になる可能性が示唆されている25。また、神経前駆細胞 (NPC) とニューロンでGTDC1(QTMAN)を欠損させると、神経変性疾患の患者から作成したiPS細胞と同様の表現型を示した26。

9. おわりに

今回私たちの研究でtRNAの糖付加酵素が二種類同定された。いずれも糖転移酵素スーパーファミリーの一員であり、タンパク質や脂質を糖付加する酵素がどのような過程を経てRNAを認識するように進化したのか、また、tRNAの認識がどのようになっているかなど、解明すべき点が多く残されている。現在私たちはQtgalとQtmanのノックアウトマウスの解析を進めており、今後は、哺乳動物における糖付加Q修飾の生理機能および疾患との関連性を明らかにしていきたい。最近、RNAに糖鎖修飾が見つかり、グライコRNAの研究が急速に進展している27。糖鎖修飾の世界（グライコーム）とtRNA修飾の世界（エピトランスクリプトミクス）が融合した先にどのような発見が待っているのか、今後もこの新しい研究分野の発展に目が離せない。

謝辞

本研究は、当時大学院生であった趙雪薇（Xuewei Zhao）さんと馬丁（Ding Ma）さんが、それぞれQTGALとQTMANを同定したところから、研究が始まった。また、cryo-EMによる糖付加Q修飾の構造解析は特任助教の石黒健介さんの成果である。彼らの絶大な貢献に対してこの場を借りてお礼を申し上げたい。最後に、長年スタッフとして本プロジェクトを一緒にけん引してくれた鈴木健夫さん(現在、琉球大学医学部教授)にもこの場を借りて感謝申し上げたい。

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