Aug 01, 2022

ガラクトシル非フコシル化免疫グロブリン製剤の抗炎症作用
（Glycoforum. 2022 Vol.25 (4), A11）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.25A11J

三村 雄輔

三村 雄輔

氏名：三村 雄輔
国立病院機構山口宇部医療センター臨床研究部
山口大学医学部医学科卒。医学博士。山口大学助手（生化学）、バーミンガム大学、オックスフォード大学糖鎖生物学研究所、サウサンプトン大学、アイルランドNIBRT博士研究員を経て、2012年から国立病院機構山口宇部医療センター臨床研究部長。IgG糖鎖の構造と機能やIgG糖鎖改変による抗体医薬開発に関する研究等に従事する。

1. 序文

IgGはFcγRや補体を活性化する一方で、自己免疫疾患においては血漿IgGからなる免疫グロブリン製剤（IVIG）が抗炎症作用を発揮する。IVIGは現在まで40年以上の長きにわたり自己免疫疾患治療の選択肢として使われており、その相反する作用機序について諸説あるが、未だに結論は出ていない。近年開発された化学酵素的糖鎖改変技術によって、ポリクローナルIgGの糖鎖をリモデリングする事が可能となった。我々は、非還元末端がシアル酸残基2、ガラクトース残基2、またはガラクトース残基0のフコシル化および非フコシル化糖鎖を持つIgGを作成し、抗炎症作用について検討した。その結果、ガラクトシル非フコシル化 [(G2)2] IgGが免疫細胞のFcγRIIIa分子に結合し、抗体依存性細胞障害を阻害することによって抗炎症効果を発揮することを証明した。(G2)2 グリコフォームはIVIGの一成分であるが、この活性成分のみからなる糖鎖改変IVIGは次世代の抗体医薬候補である。本稿ではIVIGの抗炎症機序における糖鎖の役割について最新の知見を紹介する。

2. IgGの糖鎖構造がFcエフェクター機能へ及ぼす影響

IVIGは数千以上の健常人のプール血漿からポリクローナルIgG抗体を単離し治療用として調製したものである。IVIGは高用量で特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、川崎病、Guillain-Barré 症候群などの自己免疫・炎症疾患の治療に使用される1。IVIGの抗炎症作用はFc部分にあることがITP患者へFc断片を用いた臨床試験で示されているが、その作用機序はいまだ十分に明らかでない2。一方、IVIGの抗炎症作用には糖鎖が必要である事は知られており3、我々はFc糖鎖構造がIVIGの抗炎症効果へ及ぼす影響に焦点を当てた4。

図1
図 1. IgG分子構造およびCH2ドメインのAsn297残基に結合したFc糖鎖構造

IgG-Fcは各々のCH2ドメインのAsn297残基に二本鎖複合型糖鎖を結合している（図 1）。Fc糖鎖は、免疫細胞上のFcγ受容体（FcγR）や補体C1q成分との結合によるエフェクター機能（抗原の貪食、活性酸素放出、抗体依存性細胞障害（antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC）、補体依存性細胞障害等）の発現に必須であり、糖鎖の除去はFcエフェクター機能を大きく損なう5,6。糖鎖は７糖（GlcNAc2Man3GlcNAc2）のコア構造の外側にフコース、ガラクトース、シアル酸、分岐GlcNAcが様々に付加し高度な不均一性を示す（図 1）。異なる糖鎖を持つIgG分子種（グリコフォーム)は特有の生物活性を発揮し7-9、特にフコースの除去は、FcγRIIIa結合を50 – 100倍高め、ADCCを増強する（図 2）10-13。

図2
図 2. フコシル化Fc（左）および非フコシル化Fc（右）とFcγRIIIaとの複合体の結晶構造 12

3. Fcγ受容体（FcγR）とIgGの相互作用

ヒトIgG-Fcに結合するFcγRは活性化型FcγR 5種類（FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, FcγRIIIb）および抑制性FcγR 1種類（FcγRIIb）に分類され、免疫細胞はおのおの特徴的なFcγRsを発現している14。FcγRsはIgG-Fcに対する親和性により高親和性FcγR（FcγRI; Ka＞108 M-1）と低親和性FcγR（FcγRII、FcγRIII; Ka<107 M-1）に分類される。高親和性FcγRIは、 血中でIgGモノマーを結合している15。一方、低親和性FcγRIIやFcγRIIIは主にポリメリックなIgG、すなわち抗原抗体複合体と結合するが、IgGモノマーとも血中で結合しうる4,16。最近、NK細胞上のFcγRIIIaが非フコシル化IgGを優位に結合していることが報告された17（図 3）。IgG-FcとFcγRIIIaは非対称的に結合するため（図 2）、一方のH鎖が非フコシル化されていればFcγRIIIaと高親和性結合する。血中においてFcγRIIIaと結合していたIgG1の大部分のFc糖鎖が非フコシル化であったことから（図 3左）、全ての非フコシル化H鎖がフコシル化H鎖とペアリングしていると仮定すれば、循環血中のNK細胞FcγRIIIaは非フコシル化糖鎖をもつIgGで飽和されていると考えられる。

図3
図 3. NK細胞FcγRIIIa 結合IgG（左）と血清IgG（右）のFc糖鎖のフコシル化レベルの違い17

非フコシル化IgGのFcγRIIIaへの親和性の増強は、FcとFcγRIIIaタンパク間の相互作用に加え、非フコシル化Fc糖鎖とFcγRIIIaのAsn162結合糖鎖間の相互作用が寄与している（図 2）12,13。FcγRIIIaへの高親和性のため、非フコシル化IgGは、免疫複合体のポリメリックIgGとFcγRIIIa結合で競合しうると考えられる。重要なことに、FcγRとIgGモノマーが１対１で結合する場合、免疫細胞の活性化は起こらない8,18。そこで我々は、血漿中の非フコシル化IgGのFcγRIIIaへの高親和性結合は、NK細胞のADCCを阻害できるという仮説を立てた。

4. IVIGグリコフォームの抗炎症作用

まず我々は不均一なFc糖鎖を有する正常血漿IgGから均一シアル化、ガラクトシル化、または非ガラクトシル化Fc糖鎖を持つフコシル化IgGグリコフォーム [(S2G2F)2、 (G2F)2、(G0F)2]、および非フコシル化IgGグリコフォーム [(S2G2)2、(G2)2、(G0)2]を作製した （図 4）19,20。

図4
図 4. 正常血漿IgG、SNAレクチン結合IgG、および糖鎖改変IgGグリコフォームのFc糖鎖の親水性相互作用クロマトグラフィー分析
糖鎖改変IgGグリコフォームは、SNAレクチン結合IgGと異なり、均一な糖鎖を有する。

免疫細胞FcγRIIIaは、標的細胞をオプソニン化したIgGを認識してADCCを引き起こす。我々は、血漿IgGグリコフォームがFcγRIIIa結合でオプソニン化CD20抗体と競合し、ADCCを阻害できるか調べた（図 5左）。

図5
図 5. 血漿IgGグリコフォームによるADCC阻害
ADCCレポーターアッセイ（左）、血漿IgGグリコフォームによるADCC阻害のタイトレーション（右）

その結果、ADCCは、(G2)2、(S2G2)2、(G0)2、Nativeの順に強く阻害された（図 5右）。そして、Native IgGに比べて、(G2)2はADCC阻害能が約20倍高い事を示した4。

更に、このADCC阻害が、in vivoでも起こりうるか、コラーゲン抗体関節炎（Collagen antibody-induced arthritis）モデルマウスにIVIGグリコフォームを静注して調べたところ、(G2)2は10倍高用量のNative IVIG以上に炎症を抑制した。一方、シアル化IVIG投与群ではフコースの有無にかかわらず抗炎症効果は見られなかった（図 6）4。

図6
図 6. 均一IVIGグリコフォームの抗炎症効果
抗コラーゲン抗体をDBA/1 Jマウスに0日目に静注し関節炎を誘発。 IgG グリコフォーム（Native、(S2G2)2、(S2G2F)2、(G2)2）を 0.1 g/kg、 陽性対照Native IgGを1 g/kg、およびPBSを3日目に投与。 (A) 後脚の組織像（8日目）。 PBS投与および (G2)2 IgG投与マウス（H&E染色、100倍）。 (B) 血清 IL-6濃度（8日目）(one-way ANOVA with Tukey's multiple-comparison test)。

5. 自己免疫疾患治療におけるFcγRIIIa ブロックの重要性

以前より活性化型FcγRブロックはIVIGの抗炎症作用の一つと考えられてきたが、十分なエビデンスはなかった。ITPでは、オプソニン化された血小板がFcγRIIIa発現細胞により破壊されることや21、ITP患者に抗FcγRIIIaモノクローナル抗体を投与後、急速に血小板数増加を認めることが知られていた22,23。川崎病でも、患者のNK細胞はIVIGに反応し、免疫細胞増殖やADCC活性が減少することが知られている24。このように、免疫細胞のFcγRIIIaが川崎病やITP, 自然流産を含む多くの自己免疫・炎症性疾患の病態に関与していることが報告されているが25-27、IVIGがどのように免疫細胞の活性を調節するのかわかっていなかった。我々の研究は、IVIGの一成分であるガラクトシル非フコシル化IgGがFcγRIIIa結合により、NK細胞による細胞障害を阻害するという分子機構を初めて証明した（図 7）4。

図7
図 7. 健常時（上）および病態時（下）におけるガラクトシル非フコシル化IgGによる免疫調節

6. シアル化IgG の抗炎症機序の問題点

シアル化IgGがIVIGの活性成分として抗炎症活性を持つとの説は未解決のままである。我々の実験系では、シアル化IgGはフコースの有無にかかわらず、コラーゲン抗体関節炎マウスには抗炎症効果を示さなかった（図 6）4。シアル化IgGの抗炎症機序の作業仮説とは、シアル化IgGがC型レクチンDC-SIGNへ結合し、分泌されたTH2サイトカインに反応したマクロファージが抑制性FcγRIIb発現を増加するというものである3,28。しかし、現在その説は支持されていない。なぜならDC-SIGNはシアル化IgGと相互作用しないうえ29,30、FcγRIIbはIVIGの抗炎症作用に必須でないことがFcγRIIb欠損マウスで示されている23,31,32。実際、先行研究でシアル化IgGとして使われたSambucus Nigra Lectin（SNA）結合IgGは、モノシアル化IgGを高度に含む（図 4）3,33。モノシアル化IgGのシアル酸残基は優先的にα(1-3)-armに付加され、α(1-6)-armの非還元末端は主にガラクトースであると考えられる34。α(1-6)-armガラクトース残基はCH2ドメインの多くのアミノ酸残基と相互作用し（図 1）、Fc構造の安定化とエフェクター機能の発現に寄与する35。従って、SNA結合IgGの機能は必ずしもシアル化IgGのみの特性を反映していないと考えられる。

7. 結語

IVIGの作用機序は長年の疑問であった。我々はガラクトシル非フコシル化[(G2)2] IgGというIVIGの一成分がFcγRIIIaに高親和性結合し、免疫細胞の活性を抑制するという抗炎症機序を定量的に証明した。今後更なる有効性と安全性の検証が必要であるが、(G2)2 IVIGの開発は、低用量でのIVIG投与を可能にし、血漿使用量削減に寄与できると考えられる36。更に、強力な抗炎症作用を持つ(G2)2 IVIGは、川崎病等のIVIG不応例への有望な治療選択になりうる37。

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