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Jun 01, 2021

神経機能を制御する高機能ラクトフェリンの開発：糖鎖結合能と神経保護機能の融合
（Glycoforum. 2021 Vol.24 (3), A8）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.24A8J

中村 真男

中村 真男

氏名：中村 真男
公益財団法人佐々木研究所附属佐々木研究所、研究員
2007年茨城大学理学部卒。2012年同博士課程修了、博士（理学）。 産業技術総合研究所技術研修生、理化学研究所脳科学総合研究センター研究員、東京工科大学応用生物学部助教、産総研イノベーションスクール講師、2020年より現職。2012年日本糖質学会年会ポスター賞、2013年新学術領域研究「神経糖鎖生物学」最優秀ポスター賞、2017年東京糖鎖研究会（GlycoTOKYO）ポスター賞。糖鎖による神経機能・がんを制御する天然分子の探索と高機能分子の開発に関する研究に取り組んでいる。

序文

ラクトフェリン（LF）は、自然免疫で機能するグリコサミノグリカン結合タンパク質であり、その作用からバイオ医薬品としての応用が期待されている。筆者は、脊髄損傷を効果的に回復させる新しい治療薬の創出を目指しており、最近LFが神経軸索の伸長を阻害するコンドロイチン硫酸E（CS-E）と結合し、その毒性を中和することを発見した。そして神経保護作用をもつ顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）とLFを融合した高機能LFを開発した。ここでは、筆者らが開発した糖鎖結合能と神経保護機能を融合した高機能LFについてご紹介したい。

1. ラクトフェリンとは

ラクトフェリン（LF）は、Sorensenらによってミルクに含まれる「赤色タンパク質」として初めて報告された1。LFは、分子量約8万の鉄結合性の糖タンパク質であり、初乳、涙、汗などの外分泌液や白血球の一種である好中球に多く含まれている。LFは、3価鉄との結合能をもつ2つの球状ドメイン（N-lobeとC-lobe）から構成される（Fig. 1A）。LFは、鉄の結合度の違いにより、N-lobe側の立体構造が著しく変化する。

生体内において、LFは、哺乳類の先天性および適応免疫機能を橋渡しするタンパク質であり、その防御効果は、抗がん活性、抗炎症作用および免疫調節活性から、多数の微生物に対する抗菌活性まで多方面からの研究が進展している（Fig. 1B）。この広範なLFの活性は、LFの鉄結合能だけでなく、LFと病原体および細胞の成分との相互作用が関与する作用機序によって可能になっている。

図1
Fig.1 LFの構造とLFによる治療効果が期待される疾患

2. グリコサミノグリカン結合タンパク質としてのLF

グリコサミノグリカン（GAG）は、様々な液性因子と相互作用し、細胞運動、細胞接着、細胞増殖を制御することが報告されている2。GAGは、ウロン酸とアミノ糖の二糖構造を繰り返した直鎖状の構造をとり、細胞表面や細胞外マトリックスに存在する。GAGは、それを構成する二糖構造によって、ヘパリン（HP）、ヘパラン硫酸（HS）、コンドロイチン硫酸（CS）などに大別され、硫酸基の付加位置によって、さらにいくつかのサブタイプに分類される（Fig. 2A）。これまでHPと相互作用するタンパク質として、700種類以上の分子が同定されており、LFにおいても1980年にHPとの結合が明らかにされた3。LFのGAG結合部位は、LFのN末端領域に3カ所存在することが報告されている（Fig. 2B）。LFはHSと結合して、1）パーキンソン病モデルにおける損傷したドーパミンニューロンに対する神経保護、2）重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの侵入阻止、3）ヒト乳がん細胞の細胞増殖抑制などの効果が認められることから、LFはGAG関連疾患に対する創薬シーズとして期待されている（Table. 1）

図2
Fig.2 GAGの硫酸化構造とLFのGAG結合部位
Table.1　LFとGAGとの結合とその生物学的機能の概略 表1

3. LFがコンドロイチン硫酸Eと結合することを発見―神経機能制御への応用

近年LFとHSとの結合が、感染症やがん、神経変性疾患において重要な役割を担っていることが報告されている。一方、LFとHP/HS以外のGAGとの結合は、ほとんど理解されていない。筆者は、神経機能を制御するCSとLFとの結合を詳細に解析し、LFと結合する新たなGAGユニットを解明した21。

はじめに、4種類のCS-サブタイプ（CS-A、CS-C、CS-D、CS-E）の存在下におけるLFの二次構造の変化を解析した。その結果、コンドロイチン硫酸E（CS-E）の存在下において、LFの二次構造が著しく変化した。次に、LFとCS-Eとの結合を評価するため、中性アビジンがコーティングされたプレートにビオチン化CS-Eを添加し、CS-E固定化プレートを作製した。このプレートにLFを加え、25 ℃で4時間反応させた。その後、HRP標識抗LF抗体を加え、発色基質液TBMを添加し、450 nmの吸光度を測定した。その結果、LFは、CS-Eと直接結合した（Fig. 3A）。CS-E固定化プレートに対してLFと同時にHP、CS-C、CS-Eを作用させたところ、HPとCS-Eでは競合阻害がみられたが、CS-Cではみられなかった（Fig. 3A）。

それではLFとCS-Eとの結合は、今後どのような利用展開が考えられるか？CS-Eは、脊髄損傷時の軸索再生阻害因子として報告されており、有望な創薬ターゲットであると期待されている。筆者は、軸索伸長試験の結果から、CS-Eによる軸索伸長阻害が、LFの存在下で完全に抑制され、CS-Eを作用させていない軸索の長さに回復することを見出した（Fig. 3B、3C）。LFのみでは、軸索伸長の促進作用がみられないことから、この効果は、CS-Eによる軸索伸長阻害活性への中和作用であることが示唆された（Fig.3B、3C）。

図3
Fig.3 CS-Eによる軸索伸長阻害を中和するLF

4. CS-E結合能と神経保護機能を融合した高機能LFの開発

脊髄損傷の治療薬の開発は目覚ましく進行している。顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は、1）神経細胞のアポトーシスを抑制22、2)オリゴデンドロサイトの細胞死を抑制し、髄鞘を保護23、3）炎症性サイトカインの発現抑制23などによって、神経保護作用を示すことが報告されている。筆者らは、LFとG-CSFとの融合タンパク質（LF-G-CSF）を作製し、その効果を評価した。軸索伸長試験の結果から、CS-Eで阻害された軸索伸長は、LFとLF-G-CSFで回復したが、その効果はLF単独よりもLF-G-CSFで高かった（Fig. 4A、4C）。軸索先端部にある成長円錐は、伸長している軸索にみられる構造体であり、成長円錐が崩壊すると軸索伸長は停止する。筆者らは、成長円錐崩壊試験の結果から、LFと比較して、LF-G-CSFはCS-Eによる成長円錐の崩壊に対して、高い保護作用を示すことを見出した（Fig. 4A、4C）。

図4
Fig.4 CS-Eによる軸索伸長阻害を中和し、軸索伸長を促すLF-G-CSF融合タンパク質

5. 今後の展望

世界保健機関（WHO）の調査によると、世界で年間25万人から50万人もの人々が新たに脊髄損傷に罹患するとされているが24、いまだ根本的な治療薬は存在しない。脊髄損傷などの神経変性疾患は、高齢化社会が進む日本において、患者数の増加が懸念される難治性疾患のひとつであり、治療薬の開発が切望されている。筆者らは、HP結合タンパク質の一種であるLFが、CS-Eと結合し、軸索伸長阻害を中和することを見出した。そして神経保護作用をもつG-CSFとLFを融合することで、CS-Eによる神経成長円錐の崩壊を抑え、軸索伸長を促す高機能LFの開発に成功した。今後は、脊髄損傷動物モデルを用いた機能回復に関する科学的知見を得て、CS-Eを標的とする脊髄損傷治療薬の開発に貢献したい。

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