Jun. 03, 2019

肝臓と糖鎖【第4回】

糖鎖と肝臓の再生(2019 Vol.22 (2), A4)

福田 友彦 / 顧 建国

福田 友彦

氏名:福田 友彦
東北医科薬科大学 薬学部 細胞制御学 准教授 博士(農学)
1995年大阪府立大学大学院 農学研究科博士課程修了(今井嘉郎 教授)。 その後、大阪府立母子保健総合医療センター研究所流動研究員(関口清俊部長)・ERATO関口細胞外環境プロジェクト研究員などで薬物代謝酵素Cytochrome P450、細胞外マトリックスの研究に携わってきた。2006年より東北薬科大学(現 東北医科薬科大学) 顧建国 研究室で、Fut8の機能解明に関する研究を進めている。

顧 建国

氏名:顧 建国
東北医科薬科大学 薬学部 細胞制御学 教授 博士(医学)
1993年 大阪大学医学部生理系博士課程修了(谷口直之教授)。1993〜1997年大阪府立母子保健総合医療センター研究所研究員(和田芳直部長); 1997〜1999年米国NIHの国立頭蓋および歯科学研究所の発生生物学部門ポスドクフェロー(Kenneth M Yamada部長);1999〜2002年大阪大学蛋白質研究所助手(関口清俊教授)、2002〜2005年大阪大学大学院医学系研究科生化学助手・助教授(谷口直之教授)、2006年より現職。現在、主に細胞接着・がん転移・神経疾患・生活習慣病などの疾患における糖鎖の生物学的な機能解明に関する研究を進めている。

1. はじめに

非常に高い再生能を持つことが古くから知られている肝臓は、肝細胞と呼ばれる肝実質細胞と肝類洞内皮細胞、肝星細胞、クッパー細胞などの肝細胞以外の非実質細胞で構成されている。肝再生は、細胞間の相互作用やサイトカインや増殖因子などの液性因子によって時間的に、かつ空間的に制御されている。細胞間の相互作用や液性因子に関わる分子の多くは糖タンパク質である。

2. 肝再生について

肝臓は非常に高い再生能を持つことが古くから知られている。例えば、「ギリシャ神話の神プロメテウスは人間に火を与えたことからゼウスの怒りを買い、生きながらにして大鷲に彼の肝臓を食わせ、夜間にふたたび肝臓が元どおりに回復するという絶えることのない苦痛を与えた」とある。ヒトをはじめとするほ乳類の臓器・組織の中で、肝臓だけが例外的にもつ強い再生能力の分子メカニズムについて、国内外を問わずHigginsとAnderson1によって報告されたモデルなどを用いて精力的に研究が進められている。最近まで肝再生の様式は確認されていなかったが、70%部分肝切除後残存肝細胞の肥大と分裂による増殖が誘導され、肥大と分裂がほぼ同程度肝再生に貢献していることや2、肝臓に散在し、テロメラーゼを発現する僅かな肝細胞が肝細胞再生に寄与する「分散型モデル」を裏付ける報告がなされた3。さらに近年、ヒトの肝疾患の病態をより反映するとして成熟肝細胞よりも高い増殖能をもつ肝前駆細胞の活性化再生モデルが注目されている。肝前駆細胞の活性化制御メカニズムの解明が進められているが、採取や培養方法などにも問題が残されている。そんな中、成熟肝細胞から高い分化能をもった幹前駆細胞(CLiP)へのリプログラミングと肝分化誘導刺激による再分化の成功が報告された4。肝臓の機能は肝実質細胞(肝細胞)と類洞壁細胞(類洞内皮細胞、クッパー細胞、樹状細胞、ナチュラル・キラー(NK)細胞、肝星細胞、単球由来マクロファージ)で行われているので、肝再生のメカニズムとして、肝細胞増殖を誘導するサイトカインや増殖因子のシグナル伝達と肝再生に伴う肝血管系の新生・肝血管系-肝細胞との相互作用が重要である。液性因子のシグナル伝達に関して、非実質細胞が産生するtumor necrosis factor(TNF)やinterleukin-6(IL-6)などの炎症性サイトカインの分泌とhepatocyte growth factor(HGF)の誘導など肝細胞増殖の機序が既に示されている5,6。さらに、液性因子による刺激で、glycogen syn- thase kinase-3(GSK-3β)の増加とGSK-3β依存的な転写因子Snailの分解が生じることが肝再生に重要であることなどが報告されている7。肝再生には類洞内皮からの誘導性血管分泌シグナルが必要である8ことや、FGF7が肝前駆細胞が活性化されて肝臓の再生が行われる過程においてきわめて重要であることなども報告されている9。さらに、脳から迷走神経によって肝臓に伝えられたシグナルにより、マクロファージの活性化とそれに伴うIL-6分泌促進が肝再生を促進するなど、神経信号が重要であることも報告されている10。肝再生には肝細胞と非実質細胞間の相互作用が肝臓構築・機能発現に必須である。相互作用を理解する上で、肝細胞は上皮細胞であるにもかかわらず、明確な基底膜が形成されないという特徴を持つので細胞増殖・細胞成長に加えて、細胞社会の秩序を維持するための細胞外環境も重要である。細胞外環境は糖タンパク質の超分子複合体として細胞外マトリックス(ECM)により提供されている。細胞とECMとの相互作用は細胞膜受容体インテグリンによって、細胞外の情報を細胞内へと(outside-in signaling)伝える11。その起点となる接着斑では、focal adhesion kinase(FAK)と呼ばれるチロシンキナーゼ、細胞増殖を制御するmitogen-activated protein(MAP)キナーゼ、細胞生存を制御するPI 3-キナーゼAkt経路などが活性化される。また、接着によりインテグリンが接着斑に集積すると、増殖因子受容体も接着斑に集積する12など、相互作用している。肝再生においても、ECMからのシグナルは重要である。ここではECMの主要構成成分である糖タンパク質とプロテオグリカンに焦点を当てる。

3. 細胞外マトリックス(ECM)と糖転移酵素について

インテグリン:

インテグリンは、ECMの受容体として細胞接着に寄与する主役である。細胞とECMの間の相互作用は、接着、移動、増殖、分化、生存までも含む多種多様な細胞プロセスを制御する。インテグリンは、図1に示すようにα鎖とβ鎖から成るヘテロ二量体を形成する。各鎖は大きな細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、短い細胞質尾部をもつ。他の受容体と異なり、インテグリン自身は酵素活性をもたない。しかし、インテグリンはFAKやSrcなど多数の細胞質タンパク質キナーゼと結合する(図1)ので、インテグリンの活性化はこれらの酵素反応カスケードを起こし、最終的に細胞の挙動や遺伝子発現変化をもたらす。一方、細胞外ドメインの構造が細胞内の状況に応じて変化することでECMとの結合を適切に調節する機構も備わっている。我々の研究室では、インテグリンに付加しているN結合型糖鎖の機能を明らかにするため、α鎖に14か所、β鎖に12か所の糖鎖付加モチーフのある、α5β1インテグリンをモデルに糖鎖付加モチーフに変異を導入してその機能に与える影響を解析したところ、α5鎖のβプロペラドメインの糖鎖付加は細胞接着に、β1鎖のI-likeドメインの糖鎖は二量体の形成や細胞表面への発現に必須であることなど、N結合型糖鎖は修飾部位によって特異的な機能を持っていること13やインテグリンの細胞膜近傍にあるN結合型糖鎖は上皮増殖因子受容体(EGFR)との相互作用に重要である14ことを見いだした。また、X線結晶構造解析により、インテグリンのN結合型糖鎖部分が細胞外マトリックスとの結合をガイドしている様子が報告された15。糖鎖がインテグリンを介したシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを示している。また、核や細胞質に存在するタンパク質にN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)が1分子結合するO-GlcNAc化がある。O-GlcNAc化はタンパク質の修飾される部位がセリンまたはスレオニン残基の水酸基であることに加え、O-GlcNAc転移酵素(OGT)により転移、O-GlcNAc切断酵素O-GlcNAcase(OGA)により加水分解されるため、リン酸化と同様にダイナミックに変化することが出来る。O-GlcNAcが細胞接着、移動および接着斑複合体の重要な調節因子であることを明らかにした16

図1
図 1 インテグリンが媒介するoutside-inとinside-outシグナル
ラミニン:

成体マウスおよびヒト肝臓においては、胆管や門脈、肝動脈、中心静脈などの大きな血管基底膜において主に、α5鎖を含むlaminin 511(α5β1γ1)が発現している17,18。しかし、肝細胞や類洞内皮細胞の周囲には基底膜の存在が認められないためラミニンの発現も認められない。しかし、肝再生時は一過性に類洞にlaminin111(α1β1γ1)が発現する17。また,α5 鎖のノックアウトマウスの肝臓で胆管構造形成に遅延が認められるのは、胆管の形態形成が胆管上皮細胞の産生するα5 鎖に依存していると考えられている19。また、胆管特異的にはα3鎖を含むラミニンが発現している。α3鎖を含むラミニンlaminin 332(α3β3γ2)は糖鎖修飾の変化によって細胞接着や運動促進活性が変化する20,21。laminin 332の受容体であるα6β4インテグリンのβ4インテグリン上の糖鎖もlaminin 332の活性に影響を与える22。さらに興味深いことに、laminin 332やlaminin 511の主要な受容体であるα3β1インテグリンのコアフコシル化(後述)がα3β1インテグリンの機能に必須である23。このように、肝再生時に生じる糖鎖リモデリングによる細胞外環境の変化が肝再生に重要なことを示唆している。

フィブロネクチン:

血漿のフィブロネクチンは肝細胞によって生産される24が、通常コアフコース構造はほとんど認められない。これは肝臓にα1,6-フコシルトランスフェラーゼFut8の発現がごくわずかであるのと一致している25。しかし、胎盤組織で合成されるフィブロネクチンはコアフコース構造を持っていることが遠藤らによって30年前に報告されている。さらに、部分肝切除後コアフコシル化が増加することも報告されている26。興味深いことに、同じことがビトロネクチンでも生じていて、肝再生中には、コアフコース構造が増加することである。このように、糖鎖は組織特異性と、その組織が置かれた状況に応じて、糖鎖構造を変化させている。組織ごとの局所に特異的なECMが細胞の再生・成熟・分化など挙動に重要であり27、脱細胞化骨格を用いた肝臓再生の取り組み28からも複雑なECMの組み合わせが細胞に与える影響は大きいと考えられ、そこには糖鎖構造の変化というチューニング装置が働いている。

プロテオグリカン:

タンパク質に2糖の単純な繰り返し構造からなる巨大な糖鎖(グリコサミノグリカンあるいはムコ多糖)が結合したプロテオグリカンは様々な細胞増殖因子や細胞外マトリックス成分と相互作用している。GAG(グリコサミノグリカン)の鎖伸長を停止させる働きを持つalpha1-4-N-アセチルヘキソサミン転移酵素(EXTL2)を欠損させると、肝組織中のコンドロイチン硫酸(CS)鎖およびヘパラン硫酸(HS)鎖の量が増加する29。このグリコサミノグリカン鎖の量の増加がHGFシグナルを低下させることで、肝臓の再生過程を遅らせる30

α1,6-フコシルトランスフェラーゼFut8:

糖タンパク質に付加された糖鎖は様々な生物活性を持つと考えられているが、特定の糖鎖構造との関係を示した研究は少ない。肝がんの特異的バイオマーカーとして注目されているα1,6フコース転移酵素(Fut8)により生合成されるコアフコースは健康な肝臓ではその発現が他の組織に比べて非常に少ない。また、私たちの体の組織で例外的に高い再生能力をもつことに注目して肝臓におけるコアフコースの役割を検討したところ、部分肝切除後の肝再生初期(〜4d)にFut8の発現が強く誘導され、後期には基のレベルに戻った。さらに、Fut8欠損マウスは野生型マウスより肝再生能が有意に低下した。興味深いことに、ホモ欠損マウスだけでなく片方の染色体だけが壊れて、Fut8遺伝子発現量が半分しかないヘテロ欠損マウスでも、肝再生能の低下が認められた。そこで、部分肝切除ヘテロ欠損マウスのサルベージ経路を活性化して、Fut8の基質となるGDP-フコースの合成を増加させるため、肝切除10日前からL-フコースを経口摂取させると、肝再生能が有意に回復する事がわかった(図 2, 331。このL-フコースを経口摂取させ、GDP-フコースの合成を増加させる方法は、GDP-フコース輸送体の機能不全によるCDG-IIc型先天性N結合型糖鎖合成経路異常症でも効果が報告されている(ClinicalTrials.gov)。さらに、Diethylnitrosamine とPentobarbital を用いて肝がんを誘導したところ、Fut8欠損マウスでは肝がんの発生が著しく抑制されることを見いだした。肝がんの形成に深く関わっているとされるEGFやHGFに対するFut8欠損HepG2細胞の応答を受容体のリン酸化を指標に調べたところ、低下していることがわかった32。逆に、GDP-フコース合成を妨害するL-フコース類似体、2-フルオロ-L-フコース(2FF)を使用すると、EGF受容体およびインテグリンβ1などの膜糖タンパク質のコアフコシル化レベルの減少と下流シグナルの抑制ができる33。 Fut8の重要性を物語るように、Fut8欠損患者は見つかっていなかったが、昨年3人の患者が報告された。大変興味深いことに、多様な臨床的特徴をもつ3人の患者全てにおいて、もともとFut8の発現量が低い肝臓に異常は見られなかった34。これらの結果は、コアフコシル化が肝臓における重要な機能的モジュレーターとして作用し、健康な状態では恒常性を乱すような活性化を抑制するように働くが、部分肝切除やがん化など、恒常性が乱れるとコアフコースの減少・細胞の過活性化抑制が解除されることを強く示唆している。また、「早老症」を呈するKlotho変異マウス(kl/Kl)は、加齢に伴い肝臓でのFut8の発現および活性が増加し、老化の遅れるSnell Dwarfマウスdw/dwとカロリー制限食を与えたマウスではFut8の発現が減少するなど、肝細胞におけるグリコシル化機構が加齢中に有意に影響を受ける35ことを考えると、加齢に伴う肝再生能の低下を生体は糖鎖構造を変化させることで、補っているのかもしれない。

図2
図 2 コアフコース生合成経路
図3
図 3 Fut8欠損による肝再生抑制
A: 肝再生の経時変化
B: Fut8発現量と肝再生
C: Fut8発現量と細胞増殖シグナル
D: L-フコース投与による肝再生促進

4. 最後に

肝がん患者が肝臓を切除する場合、 肝臓の機能が良好であれば約60%までの範囲の肝臓を切除することができるが、肝硬変を合併している場合など肝再生が十分でない場合がある。がんにかかわらず、重篤な肝疾患に対する最終的な治療法として生体肝移植が行われるが、レシピエント、ドナー双方で肝臓の再生が求められる。しかし、高齢のドナーの場合、若いドナーよりその再生能力は低下しているなどドナーの肝再生も大きな課題を含むことがある。良好な状態の肝臓よりも状態の良くない肝臓の再生における糖鎖の役割の解明がより重要な課題である。精力的に進められている肝再生メカニズムに糖鎖が関わっていることは疑う余地はない。糖鎖と肝再生の関係をより深く知ることで、糖鎖のリモデリングなどを通して、肝臓に本来備わっている再生能力を引き出し、増強することで、多くの患者を救済できることが期待される。さらに、今、最も注目される肝再生の治療戦略の一つに、移植に用いる細胞(肝臓系前駆細胞・血管系前駆細胞・間葉系前駆細胞)をすべてヒトiPS細胞から分化誘導して作成するAll-iPSCミニ肝臓36がある。すべての細胞材料をiPS細胞から調製する必要があるので、iPS細胞の分化指向性も重要と考えられる。ヒトiPS細胞の肝臓系前駆細胞分化指向性・血管系前駆細胞分化指向性・間葉系前駆細胞分化指向性に関わる細胞やECMの糖鎖修飾を明らかにすることで、糖鎖のリモデリングが肝再生医療に大きく貢献することが期待される。


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