Apr. 01, 2019

C型レクチンLangerinに結合する
ケラタン硫酸糖鎖の合成展開と抗炎症作用（2019 Vol.22 (1), A3）

木塚 康彦 / 谷口 直之

木塚 康彦

氏名：木塚 康彦
岐阜大学 生命の鎖統合研究センター(G-CHAIN) 准教授
2004年 京都大学薬学部卒、2009年 同博士課程修了、博士（薬学）。2009年より8年半、理化学研究所 谷口グループで研究員として勤務、2017年10月より現職。2017年 日本生化学会奨励賞。糖転移酵素の発現、活性調節を生化学、ケミカルバイオロジーのアプローチで研究している。

谷口 直之

氏名：谷口 直之
大阪国際がんセンター 研究所長、糖鎖ーオンコロジー部部長
大阪大学名誉教授
1967年 北海道大学医学部卒、同博士課程修了。コーネル大助教授、北海道大医学部助教授などをへて1986年大阪大医生化学教授。2006年より理化学研究所グループディレクターを務め、2018年より現職。2002年 IGO Award、2011年 日本学士院賞、2018年 Karl Meyer Awardなど。多くの糖転移酵素の精製、遺伝子クローニングをてがけ、糖鎖の構造と機能に関する基礎から創薬へつながる研究を目指している。

序文

ケラタン硫酸は、硫酸化された2糖が繰り返しつながった糖鎖で、タンパク質に結合して存在している。ケラタン硫酸を構成する2糖は硫酸化のパターンが異なるものがあり、2糖の6位の水酸基がともに硫酸化された構造はL4と呼ばれている。L4は、抗炎症作用を持つことがわかってきており、特にCOPD(慢性閉塞性肺疾患)のモデルマウスにおいて肺気腫化を抑えることが示されている。その作用機序の一つとして、樹状細胞などに発現するC型レクチンであるLangerinとの結合を介した免疫細胞の機能調節が示唆されている。我々は、L4の化学的なオリゴマー化によってLangerinとの親和性を高めた誘導体を創出し、Langerinとの結合解析およびCOPDモデルマウスにおける抗炎症効果やそのメカニズムの解析などを行なっている。

1. はじめに

ケラタン硫酸(Keratan Sulfate, KS)プロテオグリカンは、コアタンパク質に直鎖の糖が結合した巨大な分子である。糖鎖の数は多いものでは数十本にも及ぶ。KSは、酸性の2糖構造が繰り返しつながったグリコサミノグリカンと呼ばれる糖鎖構造の一つである。その基本骨格は、ポリラクトサミン（ガラクトースにN-アセチルグルコサミンが結合した2糖の繰り返し構造）からなり、この2糖の中の水酸基が硫酸化を受ける (図1A)。ラクトサミンの6位がともに硫酸化された2糖構造はL4と呼ばれており、このL4が本稿の中心となる化合物である。KSを分解する酵素はケラタナーゼI及びケラタナーゼIIがよく用いられるが、L4はKSを構成する2糖であり、これらのケラタナーゼによって分解を受けず生体内でも安定である。またL4は、株式会社生化学工業がサメ軟骨由来のKSからケラタナーゼを用いて調製したものを使って以前から研究しており、マクロファージからのサイトカイン産生を抑制する作用などがこれまで明らかにされている1。一方で、L4の生体における詳細な作用メカニズムはあまり明らかになっていない。

後述するように、我々はC型レクチンLangerinがL4の受容体の候補の一つと考えられること、またL4がそうした受容体への作用を通じて慢性閉塞性肺疾患(COPD)に治療効果を発揮する可能性などを検証している。これまで3つのCOPDのモデルマウスを作成し、L4の作用とそのメカニズムについて研究してきた。さらに、L4の構造を化学的にオリゴマー化することによって、Langerinとの結合親和性を大きく高めることに成功している。以下、L4の誘導体を中心とした糖鎖とCOPDについて述べる。

2. ケラタン硫酸(Keratan Sulfate, KS)の構造と機能

KSはコア構造の違いによってKS-I, KS-II, KS-IIIの3種に分類される(図1B)。哺乳類ではKS-Iは主として角膜に多く、KS-IIは軟骨、KS-IIIは脳組織などに多い2,3。KS-Iはフィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、ミメカンなどのコアタンパク質のN型糖鎖上に存在している。KSの構造はガラクトースがβ1-4結合でN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)と結合したラクトサミンの繰り返し構造（ポリラクトサミン）からなり、角膜のKS-Iの中には硫酸化されていないラクトサミン、GlcNAcだけが硫酸化されている構造(L2)、そして、2糖ともに硫酸化されているL4の構造単位が混在している。非還元末端にシアル酸を、また内部の糖鎖にフコースを含むものもある2,3。軟骨に多いKS-IIは、コアタンパク質のセリン／スレオニンに付加したO-GalNAc型糖鎖に結合している。コアタンパクとしてはMUC1などが知られている。GlcNAcのみが硫酸化されているL2構造、二糖がともに硫酸化されているL4構造からなり、非硫酸化二糖はほとんど含まれていない。KS-IIIは主に脳に存在し、こちらも硫酸化の度合いが高い。KS-IIIはコアタンパク質のセリン／スレオニンに結合したO-マンノース型糖鎖上に存在し、コアタンパク質としてはアバカン、ホスファカンなどがある。

KSの機能としては、角膜の水分量維持が知られており、遺伝性の斑状角膜ジストロフィーは、KSの生合成に必須なGlcNAc6STの異常によって引き起こされ、角膜の水分量が低下して失明につながると考えられている4。また近年、中枢神経系でのKSの機能がよく研究されており、損傷後の軸索再生をKSプロテオグリカンが抑制することや5、ALS (筋萎縮性側索硬化症)との関連性などが報告されている6。

図1
図 1　KSの構造
(A) KSの二糖繰り返し構造とL4
(B) KS鎖が結合した3種の糖鎖構造

3. COPD（慢性閉塞性肺疾患）と糖鎖

次に、我々の糖鎖研究とCOPDとの関連性について経緯を述べたい。我々は以前から、N型糖鎖のコアフコース(α1-6フコースが結合した構造）を生合成する糖転移酵素であるFUT8の研究を行ってきた。まずヒト胃がん細胞株とブタ脳組織からこの酵素を均一に分離精製し、アミノ酸部分配列からcDNAクローニングを行った7,8。Fut8遺伝子のノックアウト(KO)マウスを作製したところ、7割のマウスは生後間もなく死亡したが、生存したマウスには肺気腫様の症状が見られ、マウスの呼吸機能を見たところヒトのCOPDに近い症状を呈していることがわかった9。この肺気腫症状の原因の一つは、肺胞に存在するTGF-β受容体上のコアフコースが欠損することにより、マトリックスメタロプロテアーゼの発現が高まり、肺胞を支える間質が破壊されるためであることが明らかになった9。さらに、Fut8のヘテロ欠損マウスは、COPDの危険因子であるタバコや実験的に肺気腫を惹起するエラスターゼ暴露に感受性が強く、通常のマウスでは実験的な肺気腫モデルの作製に6か月間のタバコ暴露を要するが、Fut8ヘテロ欠損マウスは3か月で同等の病態を呈する肺気腫モデルとなることがわかった10。このマウスをモデルの一つとし、ヒトのCOPDの研究を開始した。FUT8とヒトのCOPDについては、ヒトの血中FUT8の活性低下とCOPD患者の呼吸機能の低下に相関性があること11、また呼吸機能と相関するFUT8のSNPの存在が明らかになっている12。さらに最近、FUT8の発現が著しく低下する遺伝子変異によって生じるCDG (Congenital disorder of glycosylation) が見出された。このCDGは全身性に様々な症状を呈するが、共通して呼吸器症状を呈することが報告されており13、コアフコースを含む糖鎖とCOPDとの関連性がここでも示されている。

COPDは、慢性気管支炎と肺気腫と呼ばれてきた病気を包含する呼吸器疾患である。現在、日本では潜在患者をふくめると500万人以上の患者がいるとされるが、実際に治療を受けているのは30万人程度である。2012年時点の世界の死亡原因の4位であり、今後3位になると考えられている(WHO Health Statistics 2012)。COPDは生活習慣病の一つであり、危険因子は言うまでもなく喫煙であるが、PM2.5を始めとする環境因子もその原因となる。ウイルスや細菌感染により増悪することがあり、とくにインフルエンザウイルスやインフルエンザ菌、肺炎球菌による感染で増悪をもたらすことが知られている。また肺がんのリスク因子となることも論じられている。COPDの治療には、長期作用型のβ2刺激薬や長期作用型抗コリン薬、テオフィリン薬などの気管支拡張剤や吸入コルチコステロイド薬などが使われているが14、対症薬であるため、より根本的な治療薬の開発が望まれている。

以下、L4およびL4誘導体のCOPDへの治療薬の可能性を論じるとともに、L4の受容体候補の一つと考えられるC型レクチンLangerinとの関連性を論ずる。

4. L4による肺の抗炎症作用

前述のようにCOPDの最大の原因は喫煙である。喫煙により肺で発現が変化する糖鎖を探索したところ、KSが新たに見出された。喫煙により誘導したCOPDモデルマウスの肺におけるケラタン硫酸の発現を免疫染色で、また硫酸化酵素のmRNA発現をリアルタイムPCRで解析したところ、喫煙により5D4抗体で染色される高硫酸化ケラタン硫酸の発現が低下し、ガラクトースの6位を硫酸化する酵素Gal6st1(Chst1)の発現が低下していることがわかった15。この結果から、COPDの最大のリスク因子である喫煙によって肺におけるケラタン硫酸の発現が下がっており、それが病態形成と何らかの関係があることが示唆された。また上述のように、GlcNAcとガラクトースの6位がともに硫酸化された2糖のL4が免疫機能を調節することが報告されていることから、L4による肺の炎症に対する効果およびCOPD治療効果を検証した。

マウスにおいてCOPDを抑制する効果があるかどうか検証するため、モデルマウスを作製した。上述のFut8ヘテロ欠損マウスに3ヶ月喫煙させたマウス、および野生型マウスの気道にエラスターゼをスプレーで投与したマウスを肺気腫モデルとし、さらにそれらにLPSを単回投与して炎症を惹起したものをCOPDの増悪モデルマウスとした16。またこれらのマウスの肺機能をCTで評価する系も確立した(図2右)。

これらのモデルマウスに対して、L4を気道からスプレーで、また尾静脈注射により投与し、肺気腫化や肺で起こる炎症を抑える効果があるか検証した。その結果、L4の単回投与により、肺気腫化が有意に抑制されることがCT解析および肺切片の肺胞径測定により明らかになった(図2) 15。さらに、肺胞洗浄液中の免疫細胞数やサイトカイン量の測定により炎症の程度を解析したところ、L4の投与により、肺に遊走する炎症細胞の数と産生される炎症性サイトカインの量がともに減少していた。これらの結果から、L4はCOPDモデルマウスの肺で起こる炎症を抑制し、COPD様症状を抑えることが明らかになった。

図2
図 2　L4によるCOPDモデルマウスの肺気腫抑制効果
図はGao et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2017, 312, L268-L276より改変

5. LangerinとL4

L4がマウス肺において抗炎症作用を有することがわかったが、次の疑問はその作用機序である。KSの動物体内における機能についてはまだ不明な点が多く、特異的相互作用分子もほとんど報告がないが、動物レクチンの一つであるLangerinがL4およびKSと結合することが報告されている17-19。Langerinはカルシウム依存的に糖鎖リガンドと結合するC型レクチンの一つで、樹状細胞に主に発現して生体バリアとして働き、HIVなどの病原体の排除に関わっていると考えられている20。しかし内在性の糖鎖リガンド分子についてはほとんど知られていない。糖鎖結合の特異性としては、マンノースを含むマンナンなどの糖鎖と、6位が硫酸化されたガラクトースの両方を認識しているというユニークな性質を示している。実際、KSを発現する細胞ともLangerinは結合することから、Langerinの内因性、外因性リガンドの一つがKSであると考えられる17。また、Langerin陽性の樹状細胞がCOPD患者の肺胞洗浄液中で増加しているとの報告もある21,22。以上の点から、LangerinはCOPDの発症に関与しており、L4のCOPD抑制作用はLangerinとの結合を介する可能性が考えられた。

一方Langerinは細胞内のシグナル伝達モチーフを持たないため、単独ではシグナルを伝達しないと考えられる。Langerinがリガンドと結合後にどのような動態を示すのか、どのようにシグナルを伝達するのか、そしてL4がどのようにそれを制御するのか、現在我々はそれを明らかにするべく研究を進めている。

6. L4の誘導体化とLangerinとの高親和性結合

NMRとELISAを用いて我々がL4とLangerinとの結合を調べたところ、両者が直接結合することが確かめられた23。またその結合はガラクトースの6位の硫酸基が必須であることもわかった。LangerinはNeck領域を介して三量体を形成することが知られており、我々の解析においても、三量体を形成できないshort formではL4との結合親和性が低下した。しかし三量体を形成するlong formにおいてもL4との結合定数はmMオーダーであり、より高親和性のリガンドの創出によって生体での作用が高まることが期待された。

そこで、L4ユニットを3つつないだTriangle (Tri-L4)、ポリマー化したPendant L4を化学的に合成し(図3A)、Langerinとの結合をELISAにて測定した。その結果、Tri-L4はµM、Pendant L4はnMオーダーでLangerinと結合したことから、化学的なオリゴマー化によってLangerinとの結合親和性が飛躍的に上昇することがわかった。また、Tri-L4はLangerinの三量体構造にもフィットすることが構造モデリングによっても示されている(図3B)。さらに、大阪大学の山崎晶博士らの協力でLangerinのレポーター細胞への結合を検証したところ、L4モノマーではシグナルが惹起されなかったが、Pendant L4ではシグナルが惹起された23。さらに、骨髄由来の樹状細胞へのL4の結合を見たところ、やはりL4モノマーよりもPendant L4との結合が強いことが確認された。またエラスターゼ投与によるCOPDモデルマウスにおいてTri-L4の抗炎症作用を検証したところ、L4モノマーと同等以上の作用が確認された。これらの結果から、糖鎖リガンドの化学的なオリゴマー化は、受容体との親和性を高め、生体における作用を強めるのに有効であることが示された。

図3
図 3　L4のオリゴマー化とLangerinの3量体構造
(A) 2種類のL4の誘導体
(B) L4の3量体構造とTri-L4とのドッキングモデル
図はKizuka et al., Cell. Immunol., 2018, 333, 80-84より改変

7. おわりに

一連の研究により、糖鎖がCOPDの治療標的となる可能性があること、低分子糖鎖で見られた生理活性が化学的修飾によって高まることなどが示された。現在、L4の受容体についての詳細な解析、Langerinによるシグナル伝達機構の解析、L4のさらなる化学修飾の最適化などを行なっている。これらの基礎研究により、今後糖鎖機能がさらに解明され、新しいツールが開発されるとともに、糖鎖創薬につながることを期待している。


謝 辞

本稿で紹介した研究は多くの方々のご協力とご支援により成されたものです。特に、L4の調製は生化学工業株式会社に、L4の三量体およびポリマーの合成は同社の平山哲也氏に、生化学実験と動物実験は理化学研究所の高叢笑博士、小林聡博士、藤縄玲子氏、太田芙美氏に、COPDの臨床および動物実験に関しては日本医科大学の木田厚瑞教授,　慶應義塾大学医学部の故別役智子教授、群馬大学の前野敏孝教授に多大なご協力を賜りました。この場を借りて深く感謝致します。本稿を故別役智子教授に捧げます。別役先生は、基礎研究においても臨床医学においてもCOPDの真の専門家で、慶應義塾大学医学部初の女性教授でした。

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