β-アミラーゼの活性中心
	β-アミラーゼは澱粉の非還元末端からマルトース（麦芽糖）を遊離する酵素であり、生成物は常にβ-アノマーのマルトースである。酵素反応によってアノマー型の反転を伴い、Koshlandによってグルコアミラーゼとともに代表的な反転（inverting）酵素に分類されている。本酵素はダイズ、サツマイモ、オオムギなどの高等植物および一部の微生物に分布し、分子量は5-6万の単純タンパク質で構成されている。高等植物の酵素とバクテリア起源の酵素とは至適pHなどの性質に差があり、微生物起源の酵素が生澱粉を吸着、分解することができるのに対して、高等植物起源の酵素には生澱粉分解活性はない。 　 　β-アミラーゼの立体構造はダイズ起源の酵素のＸ線結晶構造解析が最初に行われ、サツマイモ、オオムギおよびBacillus cereus起源の酵素の構造が明らかにされている。その結果、触媒ドメインは(β/α)８バレルから成り、β-バレルのＣ末端側に形成されるクレフトは(β/α)８バレルの３番目、４番目、５番目からのびる長いループによって取り囲まれ、深い活性部位のポケットを形成している。植物酵素のＣ末端はバレルを囲む長いループになっているが、Bacillus cereus起源の酵素ではこのループが澱粉吸着ドメインに置き換わっている、β-アミラーゼの(β/α)８バレル構造はα-アミラーゼファミリーの酵素の触媒ドメインを構成する(β/α)８バレルとは異なりヘリックスの数やループ構造に共通性は認められず、両者は異なるファミリーに属すると考えられている。 　 　本酵素の反応機構はダイズ酵素とマルトースとの複合体のＸ線結晶構造解析の結果から、推定されている。マルトースは２分子が活性部位の触媒部位を挟んで結合するが、これは１分子のマルトースが生成物のβ-アノマーの形でサブサイト1-2に、もう１分子がサブサイト3-4に結合することで可能になっている。図１-aに２分子のマルトースと相互作用する酵素の側鎖を示した。サブサイト１から４までのサイトはグルコース残基と8-10本の水素結合を形成するのに対して、サブサイト４ではHis300との間に１本の水素結合しか形成せず、その代わりに周囲の疎水性残基と多くのファンデアワールス接触をしている。残基番号９６から１０３の部分はフレキシブルループを形成し、シクロデキストリン複合型ではオープン構造をとるのに対して、マルトース複合体ではクローズド構造をとり、基質の結合に関与する。この複合体で注目すべき点はサブサイト２と３の間で糖鎖の２面角が１８０゜近く回転して結合していることであり、このことが触媒機構に深く関わっている。サブサイト２と３の間にある触媒部位にはGlu186の側鎖がサブサイト３のO1の近くに、Glu380の側鎖がサブサイト２のβ-アノマーのO1の近くに配置され、水素結合を形成している。 　 　これらのことから本酵素の触媒機構は図1-bのように推定されている。Glu186は一般酸触媒として働き、グリコシド結合のOに水素を付加し、反対側からGlu380が一般塩基触媒として、触媒水から水素を引き抜き、活性化された水がサブサイト２のグルコース残基のC1原子を攻撃し、水酸基を付加する。この際、水分子の攻撃が常にβ-アノマーの位置からおこるため、生成物がβ-アノマーに固定されることになる。また、サブサイト２に結合しているグルコース残基の環はハーフチャアーに近い平面性を示すことから、反応の中間体として、カルボニウムカチオンの存在が推定される。この切断過程が終了し、フレキシブルループがオープン構造をとった時に生成物が放出され、次の基質が取り込まれると推定されている。
図１
	三上文三　（京都大学食糧科学研究所）
	References (1) B, Mikami et al., Biochemistry 32, 6836-6845, 1993 (2) B, Mikami et al., Biochemistry 33, 7779-7787, 1994 (3) B, Mikami et al., Biochemistry 38, 7050-7061, 1999
2000年 6月 15日