エンド-β-マンノシダーゼ
	ニホンナシ(Pyrus pyrifolia)花柱のS-RNaseの糖鎖構造解析で、N-アセチルグルコサミン２残基からなるGlcNAcβ1-4GlcNAc構造が主なN-配糖体糖鎖として存在していることが明らかとなった（１）。Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc等の中間の大きさの糖鎖が全く検出されなかったことよりManβ1-4GlcNAc結合がエンド型で加水分解されている可能性が示唆された。 N-配糖体糖鎖がアスパラギン残基に結合している部位周辺に働くエンド型酵素は、これまでに２種類が知られている。一つは、アスパラギン残基と還元末端N-アセチルグルコサミン残基間の結合を加水分解するもの（ペプチドN-グリカナーゼ）で、もう一つはN-アセチルグルコサミン残基間を加水分解するもの（エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ）である（下図参照）。一方、Manβ-結合を加水分解する酵素で知られているものとしては、マンノース残基を非還元末端から一残基ごとに加水分解するβ-マンノシダーゼがマイマイや酵母等に、β-マンナンをエンド型に加水分解するβ-マンナナーゼが菌類や植物種子等に存在することが知られている。しかしこれまでにN-配糖体糖鎖のManβ-結合をエンド型で加水分解する酵素については報告がなかった。
	テッポウユリの花から得た粗酵素溶液から、硫酸アンモニウム沈澱による分画、DEAE-Sephacel、Q-Sepharose陰イオン交換、Superdex 200 ゲルろ過、HA 1000 hydroxyapatite、Poros PE/M疎水、Mono Q陰イオン交換、Superdex 200ゲルろ過の各クロマトグラフィーを用いて酵素の精製を行なった。 Manα1-6Manβ1-4GlcNAc2-PA、Manα1-3Manα1-6Manβ1-4GlcNAc2-PA、Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6Manβ1-4GlcNAc2-PAを基質として、生成物のPADによる検出を行った。それぞれ基質が減少し、GlcNAc2-PAとオリゴマンノースのピークの増加が見いだされたが、Man、Manβ1-4GlcNAc2-PA、GlcNAc-PA等は検出されなかった。このことより、Manβ1-4結合のみの加水分解がおこっていると考えられた。さらに、(Manβ1-4)6やp-nitrophenyl β-mannoside を加水分解しないことから、既に報告のあるβ-マンナナーゼやβ-マンノシダーゼとは異なる酵素であることが示された。以上の結果より、本酵素はN-配糖体糖鎖に働くエンド-β-マンノシダーゼであることが確認された（２）。 　Superdex 200ゲルろ過カラムによるエンド-β-マンノシダーゼの分子量は78,000、至適pHは約5.0付近であり、金属イオンを要求しなかった。用いた基質の中ではManα1-6Manβ1-4GlcNAc2-PAが最も良く加水分解された。Manα1-3Manβ構造をもつManα1-3Manβ1-4GlcNAc2-PA、Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc2-PAや、Xlyβ1-2Manβ1-4GlcNAc2-PA、Manα1-6(Xlyβ1-2)Manβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc2-PAは加水分解されなかった。しかし、Manβ1-4GlcNAc2-PAはゆっくりと加水分解された。
	長谷　純宏（大阪大学大学院理学研究科）
	References (1) T, Ishimizu Y, Mitsukami T, Shinkawa S, Natsuka S, Hase M, Miyagi F, Sakiyama S, Norioka : Presence of Asparagine-Linked N-acetylglucosamine and Chitobiose in Pyrus pyrifolia S-Rnases Associated with Gametophytic Self-incompatibility. Eur. J. Biochem. 263, 624-634, 1999 (2) A, Sasaki M, Yamaguchi T, Mega S, Norioka S, Natsuka S, Hase : Partial Purification and Characterization of a Novel Endo-β-mannosidase Acting on N-linked Sugar Chains from Lilium longflorum Thumb.J. Biochem. 125, 363-367, 1999
2001年 9月 15日