Hyaluronan Image Symbol
I はじめに
II 細胞内ヒアルロン酸の証拠
III 細胞内ヒアルロン酸、細胞成長および運動
IV 細胞内ヒアルロン酸の予測される役割
V 結語
 Authors' Profile
Stephen Evanko: Stephen Evanko はニューメキシコ大学で1990年と1993年にそれぞれ修士および博士号を取得した。彼の研究は、力学的負荷の変動に対する結合組織の反応と、腱および線維性軟骨の物性におけるプロテオグリカンとヒアルロン酸の役割に焦点を当てた。その後、ワシントン大学病理学部のThomas Wight博士の研究室に移り、ポスドクとして平滑筋細胞の増殖と移動におけるヒアルロン酸とプロテオグリカンの役割を研究した。現在はシアトルのHope Heart Instituteの心臓血管研究部門の研究者として、動脈壁と心臓血管病の生物学におけるヒアルロン酸の研究を続けている。
Thomas N. Wight: Hope Heart Research Institute、シアトル、アメリカa

aWight博士のプロフィールは、本シリーズのアテローム性動脈硬化症と再狭窄におけるヒアルロン酸を参照。
I はじめに 
ヒアルロン酸(以下HAと略記)の単純な構造は、その生物学上の機能および物理化学的特徴が示す複雑性と矛盾する。細胞の接着と移動および細胞の成長と分化等の制御から、関節の粘凋性保護作用や眼の外科的応用まで、HAはその機能に驚くべきレパートリーを持っている。この用途の広い分子に関する研究の最前線は細胞の内側にあり、そこではHAおよびHAに結びついた細胞内ヒアルアドヘリン(hyaladherin)が新規で重要な一連の機能を担っている可能性がある。この分野の研究は始まったばかりである。

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II 細胞内ヒアルロン酸の証拠
HAと他のグリコサミノグリカンが、細胞質および核において検出されたという報告が初めて発表されたのは1970年代である。そこでは放射性代謝標識と細胞分画、あるいはオートラジオグラフィーを含む様々な技術が採用されていた。糖タンパクやコンドロイチンは、[3H]グルコサミンで標識されたHeLa細胞の核とクロマチン標品から検出された1。コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、HA、ヘパラン硫酸がラット脳2および肝細胞3-5の核に見いだされた。硫酸化プロテオグリカンが、高感度オートラジオグラフィーを用いて、皮膚の線維芽細胞の細胞質および核の両者から検出された6。これらの初期の研究は、細胞分画の技術が部分的に精度に欠けていること、およびその他の技術の人為的エラーが存在する可能性から幾分疑わしいものであった。HAに関して、ポリマー合成が細胞膜で行われるというその後の発見によってもまた疑問が生じ、細胞内HAの存在はその可能性が薄いという考えを生み出していた7
 
 しかしながら、細胞内HAが存在するという証拠は増え続けた。現在では、HAは細胞内に取り込まれて分解され、恐らく多くの重要な機能を営んでいるということが明白になってきている。最近の証拠の大半は、主に光学および電子顕微鏡を用いた形態学的研究からもたらされている。これらの研究は金コロイドあるいはビオチンを結合させたHA結合分子のプローブ、あるいは蛍光標識HAを用いておこなわれた。

睾丸ヒアルロニダーゼ-金複合体を用いると、強い色調の金標識が、卵丘細胞卵母細胞複合体の卵母細胞や顆粒膜細胞9と同様に、膵臓細胞や小腸組織8の粗面小胞体にも見られた。これらの研究では、核辺縁部や仁体核周辺での高密度ヘテロクロマチンの確かな標識化もみられた。(Fig. 1) この標識の特異性は、睾丸ヒアルロニダーゼによる切片の消化前処理と、過剰のHAと金結合酵素とのインキュベーションにより証明された。しかしながら、睾丸ヒアルロニダーゼはHAに絶対的に特異的というものではないということから、これらの研究における染色のいくつかはコンドロイチン硫酸を表しているかもしれない。
Fig. 1.
膵組織におけるヒアルロニダーゼ-金の局在。 膵腺房細胞の一部位が、核ヘテロクロマチン、仁核、粗面小胞体を重い金で標識して示されている。バーは750 nm。顕微鏡写真はMoise Bendayan博士(モントリオール大学 医学部 解剖学科)のご厚意により提供された。
他の研究では、軟骨プロテオグリカン・アグリカンや軟骨リンクプロテイン等、HAにより特異的なコンドロイチン硫酸とは結合しないプローブを採用した。ラット脳のin vivo研究において、HAは軸索内に、また小脳ニューロンには選ばれた一部の核内に、あるいは顆粒細胞の細胞質に局在していた10。わずかな細胞の中にのみHAが分布するというその選別性から、これは人為的エラーの可能性は低いと思われた。ラットの血管の超微細構造の研究では、金結合リンクタンパクおよび金結合アグリカンの両者が、in vivoでのHAの形態学的局在性を見るのに使われた。内皮細胞および平滑筋細胞において、HAは細胞の通常の表面よりも、膜のカベオレの部位により多く検出された11 (Fig. 2) 。これらの著者達はまた核のヘテロクロマチンにもHAを検出した。これらの研究における染色の特異性は、HAに非常に特異的なStreptomycesヒアルロニダーゼの消化によって染色性が消失することにより確認された。
Fig. 2.
リンクタンパク-金で標識した動脈壁の詳細。金標識(15-20 nm粒子)は平滑筋細胞膜のカベオレ部位に多く見られる。倍率はx108,000。顕微鏡写真はPeter Eggli博士(ベルン大学 解剖学研究所、スイス)のご厚意により提供された。
最近ではアグリカンのHA結合部位のビオチン化したものを用い、光学顕微鏡下に培養細胞の細胞内HAの証明をした12, 13。培養細胞では、細胞膜透過処理前に細胞周囲のマトリックス中のHAを除去できるので、細胞内物質を見るのに有利に働く。(Fig. 3) この方法により、HAは平滑筋細胞や線維芽細胞内に分散した網状ネットワーク中に見られた。HAはまたいろいろなサイズの小胞にも検出される。これらは蛍光標識HAを用いた細胞内取り込み実験から、エンドソームの小胞であることがわかった(以下を参照)。また、電子顕微鏡による研究とも一致するが、染色されたHAは核、それはしばしば核辺縁部および/または小核に結合して見られる。細胞内HAは、この方法で、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、正常乳腺上皮細胞、乳腺腫瘍細胞、および表皮のケラチノサイトを含む多くの細胞で検出されてきた。このことはHAを作り出している細胞に一般的な現象であることを意味している。
Fig. 3.
細胞内および核のHA。ビオチン化したアグリカンのHA結合部位を用いたヒト平滑筋細胞におけるHAの組織化学染色。ペルオキシダーゼの基質にはAECを用いた。(A)無処理細胞、(B)固定前にStreptomyces ヒアルロニダーゼで細胞を処理、(C)細胞をヒアルロニダーゼ処理後、透過処理、(D)細胞を透過処理後ヒアルロニダーゼで再処理。Cにおける矢印は核小体染色を示す。図は文献12から許可を得て複製。
細胞内HAの分布に関する多くの知見を記してきたが、これらの所見の意義は未だ明白ではない。例えばヒト皮膚線維芽細胞では、HAははっきりとした核の裂け目および溝に明確に結合していた。内皮細胞培養でコンフルエントに達していない部位では、HAは細胞外よりも細胞内の方がより豊富にあるように見られた。ある乳線腫瘍細胞では細胞内HAは、典型的な分散状態にある細胞質の染色性と比較すると、より“球状”の外観を持っているものが見られたが、それらは膨張した不規則な形の小胞に局在しているように見えた。このことは細胞内HAの形態と分布が、細胞のタイプかまたは他の因子によることを示唆している。
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III 細胞内ヒアルロン酸、細胞成長および運動
最近のデータは、細胞内HAが成長制御および有糸分裂に関与しているらしい事を示唆している14, 15。HAは有糸分裂細胞により大量に合成されており、細胞周辺を囲むはっきりしたマトリックスを形成しており、これは粒子排除アッセイを用いると見ることができる16。細胞周囲のマトリックス中では、HAは、部分的にはHA依存性マトリックスの立体排除特性により、膜での襞形成、接着斑の代謝、細胞の脱着と球形化等を促進する。この周囲を覆うコートはまた、HA結合性をもつプロテオグリカンであるアグリカンやバーシカン、さらにはリンクタンパク、TSG-6やインター−α−トリプシンインヒビター等のHA結合分子を含んでいる。そしてこれらの分子はすべて、HA依存性マトリックスの物理化学的、生物学的特性に関与している。HAはまた、CD44やRHAMMのような細胞表面レセプターにより伝達されるシグナルを通じて、細胞機能を制御しているb

b本シリーズの「ヒアルロン酸レセプター、CD44」Knudson / Knudson、「RHAMM、hyaladherinsのメンバー」Turley / Harrisonを参照。
 
しかしながら平滑筋細胞、線維芽細胞、上皮性ケラチノサイトおよびその他の細胞では、有糸分裂の際の細胞外HAの増加は、細胞内HA量の同時的増加と平行していることは特筆される。例えば、血清除去により成長を休止した3T3細胞では、細胞内HAはほとんど検出されない。血清や血小板由来成長因子(PDGF)の成長刺激に従って、円形化した有糸分裂細胞において最高となるような、細胞内HA濃度の確実な増加がある(Fig. 4)。同様に、ラットの上皮性ケラチノサイトでは、コンフルエントに達した培養細胞と比較しコンフルエントに達していない培養細胞ではより多くの細胞内HAが存在する13。コンフルエントに達した培養ケラチノサイトを上皮性成長因子で刺激すると、3T3細胞と同様に、細胞内HAの染色が増加し、このことは有糸分裂細胞でより明らかに強く染色された。In vitroの創傷に引き続いて起こる、細胞移動に関連した細胞内HAの量の増加はケラチノサイトでも見られた。細胞内の高濃度のHAは有糸分裂期の平滑筋細胞においても見られてきた(Fig. 5)。
   
Fig. 4.
有糸分裂に関連した細胞内HA。血清刺激後透過処理した3T3細胞のHA染色例。(A)コントロールとしての中間相の細胞、染色像は見られない。(B)血清刺激後24時間の細胞、HAは細胞質に蓄積、核近傍で濃縮される。(C-F)血清刺激後27時間の全ての有糸分裂細胞に強い染色像が見られる。前期の後半/前中期の前半において(C)、染色体は中心部の周囲に放射状に配列され、染色像は染色体間に見られる。中期においては、(D)HAは細胞を満たし、中期板では染色体の周辺を満たしている。後期では(E)、染色は細胞の対極に移動する染色体の間に見られる。 強い染色像は終期を通して続く(F)。バーは25 μm。図は許可を得て文献12から複製した。
Figure 5.
HA()とTSG-6()を染色したヒト結腸平滑筋細胞の共焦点イメージ。核はDAPI()で染色した。顕微鏡写真はCarol De La MotteとJudy Drazba(クリーブランド州、オハイオのCleveland Clinic Foundation)のご厚意により提供された。
3T3細胞の有糸分裂期の間、HA染色は細胞全体を満たし、有糸分裂中期には染色体間に伸展しているように見られる。次いで、HAは後中期には分離した染色体間のスペースを満たす。強い染色性は終期まで残存する。抗チューブリン抗体を用いた二重染色では、HAは有糸分裂紡錘体および中心体と一緒に局在するが、明確には紡錘体線維に限局されていない事が示唆された(Fig. 6)。大きなHA陽性小胞が、有糸分裂している3T3細胞や上皮性ケラチノサイトの分裂溝でできたくびれに見られることが注目されてきた(Fig. 7)。HAは、以前細胞質分裂を促進すると提唱された分裂溝によるくびれにおいて、細胞外に大量に濃縮されて見いだされていたが15、しかしこの場所での小胞内でのHAの役割は明白ではない。このように、HAの合成が高まり、細胞周囲のコートがもっともはっきりとした時、細胞内HAの量もピークに達する。これはHAが細胞増殖と移動の間に急速に代謝されることを、そして細胞の内外で多くの機能を果たしていることを示唆している。

Fig. 6.
HAは有糸分裂紡錘のチューブリンに局在。有糸分裂中の3T3細胞の2例、HA()とチューブリン()の二重染色。共存は中心体および紡錘線維に見られる。HAの強染色部位は分裂装置の外側にも存在する。(Fig. 4と比較)
Fig. 7.
HA陽性の小胞が分裂溝に存在する。将来の分裂溝の位置(矢印)に大きく目立ったHA陽性小胞を有する、有糸分裂中3T3細胞の一例。
細胞内HAの起源となる場所の報告はその数が限られているし、細胞質や核への移行の仕方もわかっていない。成長を休止した3T3細胞が血清やPDGFで刺激し、蛍光標識HAを24時間取り込ませたとき、刺激を受けた細胞は受けなかった細胞に比べて多くの外からの標識HAを取り込むことがあるという研究がある。しかしながら、蛍光シグナルは大きなエンドソームの小胞に限られているようであり、残りの細胞質内の内因性HAとは一緒に局在しなかった(Fig. 8)12。これはフルオレセイン標識HAは、内在性の標識されていないHAが細胞質部位に効果的に移動されるようにはいかないことを強く示唆している。(これはまた機能の評価に蛍光標識HAを使用することに非常な困難があることを指摘しているものである。)しかしながら、HAポリマーの一部が細胞膜の内面で合成されて細胞質に直接蓄積する可能性、あるいは細胞表面への、または表面からの途上にある小胞内でHAが合成される可能性がはっきりと除外されてはいない。別の研究では、10T1/2細胞が運動性を増加させるに従いテキサス−レッド標識のHAを急速に取り込み、そのシグナルは細胞質と核で数分以内に見られることを示したが、このことはHAが細胞の外側から移動したことを示唆している17。フォルボールエステルのPMA刺激は、テキサス−レッド標識のHAの細胞質と核への取り込みを促進し、HAとの相乗作用により運動性を増加させた。

Fig. 8.
HAの取り込みは血清刺激に反応して増加する。血清刺激細胞とその対照細胞は24時間、フルオレセイン標識HA()を取り込ませ、その後固定し、内因性細胞内HA()を染色した。対照の静止細胞はフルオレセイン標識HAの最小の取り込みを示し、内因性HAは細胞質では染色されなかった(A)、一方、刺激細胞はフルオレセイン標識HAの取り込みを促進するとともに、細胞質に強いHAの染色性を示した。しかしながら、内因性HAの局在部位はエンドソームの小胞におけるそれとは違っているように見られることに注意。バーは25 μm。文献12からの図は許可を得て複製した。
これらの研究は、HAの細胞内取り込みが厳密に制御されており、細胞の移動と増殖の際に、HAの合成が増加するのと同時に起きることを示唆した。これはHAの細胞内取り込み、転位および、おそらくは分解のプロセスが細胞増殖と運動の制御に重要な役割を演じていることを意味している。

もう一つの最近発表された多分より確信させる研究では、ラット上皮のケラチノサイトにおける内因性細胞内HAが、HAオリゴ糖で細胞を前処理すると消失したことであり、このことは細胞外マトリックスから確かに内部移行したことを示唆する13。取り込みはHA10で阻害されたが、HA8, HA6ではされなかった。CD44の抗体は細胞内HA量の増加を引き起こすが、これはCD44が何らかの形でそのプロセスに関与していることを示唆する。FITC-HAは、クラスリンでコートされたピットとは関連しない、CD44を含む受容体を介したエンドサイトーシス経路を通して、200-600 nmの細胞質小胞の中へ移行した。貪食作用のマーカーである標識デキストランとの共局在化がないことからわかるように、細胞外HAの大部分は液層からのエンドサイトーシスによらないことがわかる。カベオリン1との共局在化がないことと、フィリピンやナイスタチンのようなカベオレの形成阻害剤の細胞内HA量におよぼす作用がないことから、これらの細胞のカベオレ内にはHAは存在していないことがわかった。細胞内HAはゴルジマーカーとも共局在化しなかった。内因性HAの大部分が低分子量(< 30 kDa)であった。クロロキンや塩化アンモニウム等によるリソゾームの機能阻害剤が細胞内HAの蓄積を引き起こすことから、終局的にはリソゾームでの分解を受けるように運命づけられていることを示唆している。しかしながら、パルスチェイスと分解に関する研究に基づくと、平滑筋細胞や他の細胞内に移行したHAは、最初から低分子量であった13, 18。ケラチノサイトでは、一度HAがリソゾーム部位に到達すると、細胞内には非常に小さなオリゴ糖がほとんど検出されないことから、それは速やかに代謝されることがわかる。

フルオレセイン標識HAもまた、細胞内結合部位を特定するために用いられてきた(Fig. 9) 12。透過処理し、成長を休止した3T3細胞では、フルオレセイン標識HAの多くは核小体に結合し残りの核や細胞質にほとんど結合しなかった。血清で刺激した後では、標識HAの細胞質における結合量が明確に増加した。強い結合が核全体に、および/または核辺縁部にも見られたが、コントロール細胞に見られるような核小体に主に局在するようなことはなかった。これは細胞内HAの増加を伴う血清刺激により、細胞内HA結合分子の増加と再配置が起こることを示唆する。3T3細胞やヒト平滑筋細胞では、フルオレセインHAは内因性HAを含む小胞の周辺部に多くが結合したが、このことはエンドサイトーシスを受ける小胞周辺にHA結合分子が存在することを示唆しており、この結合分子はHAの細胞内移動プロセスに関与しているようだ(Fig. 10)。

Fig. 9.
血清刺激後の細胞内HA結合部位の再分布。固定し透過処理した3T3細胞を、細胞内HA結合部位を特定するためにフルオレセイン標識HAとインキュベートした。対照細胞は(A)、10%ウシ胎児血清で24時間刺激した細胞は(B)。対照細胞では、標識HAは主に仁に結合し、細胞質ネットワークにはわずかであった。血清刺激細胞では、フルオレセイン標識HAは核や核辺縁部を含めて細胞質に広範囲に結合していた。未標識HAで細胞をプレインキュベーションすると、標識HAの染色性は消失した(データは示さず)。バーは25 μm。文献12からの図は許可を得て複製。
Fig. 10.
HAを含む小胞へのフルオレセイン標識ヒアルロン酸の結合。ヒト皮膚線維芽細胞を固定し、透過処理し、内因性細胞内HA()を染色し、その後HA結合部位()を調べるためにフルオレセイン標識HAとインキュベートした。内因性HA(矢印)が陽性の大型の小胞辺縁部に、フルオレセイン標識HAが結合したことに注意。また核辺縁部や核小体に蛍光標識HAが結合したことにも注意。
HAの細胞内取り込みは多くの細胞種で有糸分裂に連動しているし、成長因子または血清刺激後に増加するという観察結果は、HAの分解とヒアルロニダーゼ活性の亢進が、細胞がコンフルエントになることによるコンタクトインヒビションに由来する成長休止に連動する、という以前の研究とは明らかな矛盾があるc。これは使用した細胞の違いか、血清除去による成長休止とコンタクトインヒビションの相違、のいずれかを反映したものであろう。いずれにしても、細胞増殖と運動性におけるHA分解の役割は全く不明で、この分野での将来の研究対象となろう。HA断片は高分子量のそれと比し異なった生物学的活性を持つことが知られていることから、HAの分解と断片の生成は、それが細胞外であれ細胞内であれ、細胞の成長と運動性の制御に重要な役割を演じている可能性がある。

c 本シリーズのStern / Csókaの「ほ乳類ヒアルロニダーゼ」を参照。

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IV 細胞内ヒアルロン酸の予測される役割
細胞の増殖と移動における重要な時期に、HAが細胞内に存在するという発見は、これらのプロセスの制御において、HAが細胞内での作用様式を持っているだろうことを示唆する。一つの推測される可能性としては、HAの取り込み、移動、そして恐らく分解の過程は、細胞内HA結合分子(IHABPs)またはヒアルアドヘリンと共同で、シグナル伝達と制御メカニズムにとり欠くことのできないものであろうということである。しかしながら、この分野は未成熟の状態にあり、細胞内HAの大部分の機能側面はまだ全く推測の域を出ないものである。加えて、細胞内と細胞外の作用を区別することはHAを介した重要な作用が細胞表面と細胞内の両者で同時に起っているらしいことから、実験的には困難である。

Fig.11に描かれたモデルは、細胞内HAの推定される役割を示している。これまでの限られたデータから、HAは多分取り込まれ移動させられるものと示唆される。しかしながら、HAの細胞質やまたは核への移動の仕方は、もしそのようなメカニズムが実際に存在するとしても、全くわかっていない。HAポリマー上の疎水性“パッチ”はそれ同士19およびリン脂質20と相互作用をしているらしく、これがHAの移動にいくらか関係するかも知れない。他方完全には除外しきれない別の可能性として、HAS酵素のある分子群によるHAの細胞質内方向への合成が考えられる。

Fig. 11.
既知のHA結合タンパクまたはヒアルアドヘリンとの相互作用を通した、細胞内HAの予測される局在場所と機能を描いたモデル。
HAは明らかに細胞外マトリックスの構造上の役割を担っているが、そのことから細胞内においても類似の機能を持つことを想像することは容易なことである。ヘテロクロマチンとHAの会合、および核辺縁部への外因性HAの結合は、HAが核マトリックスの一部となり、ある種の足場として作用することを示唆している。有糸分裂の際に多量に見られることは、HAがこのプロセスにある役割を演じていることを示唆する。リン脂質との相互作用20があることから、分裂の際に膜機能に対してある役割を示唆する。分裂溝におけるHAを含んだ小胞は、細胞質分裂で提唱されているHAとの役割と関係があるようだ15。rRNA合成部位である核小胞におけるHAと、リボゾームが運ばれてくるところのrERに存在するという報告があることの間に、機能的なつながりがあるのではという興味深い可能性もある。進展している成長板の肥大化軟骨細胞では、大部分のHAは細胞内にあり、細胞の伸展と肥大化の作用に関与していることが示唆される21。細胞質と核に移行したHAは、転写因子またはステロイドのような他の分子の移動を支援しているかもしれない。

より推測的でない所見として、一連の潜在的機能を持った細胞内のいくつかのヒアルアドヘリンについて論じられてきており、より多くのことが発見されるのは確実である。RHAMM/IHABPは多機能を備えたヒアルアドヘリンであり、HA結合モチーフ-BX7B-を含む多くのヒアルアドヘリンの一つである。ここでBはアルギニンまたはリジン、Xは非酸性アミノ酸のいずれかのアミノ酸を表し、また少なくとも塩基性アミノ酸のひとつが付加されてモチーフの中あるいは近傍に存在している。RHAMMはHAを細胞に加えるとその後に細胞表面に一時的に“ぱっと現れ”、そしてHA誘導性の運動の制御に関与するd。RHAMMはポドゾームに局在し、接着斑の分解に関与するものと思われる。RHAMMの細胞内型はERK1に結合し、その活性化を促進し、その後成長因子にさらされると、ERK1の活性を弱めることである。RHAMMは微小管に結合し、有糸分裂の紡錘体中にERKと共に局在することから、アクセサリータンパクとしてこのMAPキナーゼが基質に接近するように働いているようだ。細胞内HAは分裂紡錘体のチューブリンと部分的に一緒に分布し(Fig. 6)、RHAMM/IHABPが関わる制御プロセスの一端に位置していることは明らかである。このように、HAはシグナル伝達事象が起きるとき、ある種の足場の役割を果たしているのであろう。しかしながら、HAが実際にRHAMM、ERK1と3成分からなる複合体の一部であるかどうかは明白ではないし、HAが別の推定される細胞内作用を行っている時にRHAMMと結合しているかどうかもわからない。

d 本シリーズの「RHAMM、hyaladherinsのメンバー」Turley / Harrisonを参照。

もう一つの細胞内ヒアルアドヘリンについても記述されており、これは分子クローニングを通じて、P32と同等であることが見いだされた。P32はスプライシングファクターであるSF222と共に純化されてきた分子である。P32はチロシンのいくつかの潜在的な硫酸化部位と、またERKやプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIの基質として作用するいくつかのリン酸化部位とをもっている。カゼインキナーゼIIは全ての細胞の核と細胞質に普遍的な分子であり、SF2とプレ-mRNA結合分子をリン酸化することが知られている。それ故、カゼインキナーゼIIリン酸化の能力により、P32はSF2のスプライシング活性をコントロールする候補となっている。このようにして、核におけるHAの局在、および粗面小胞体に存在する可能性は、mRNAのスプライシングと遺伝子発現の過程に関連するかもしれない。

酵母細胞の細胞サイクルをコントロールするタンパクであるCdc37の脊椎動物におけるホモログは、また別の細胞内ヒアルアドヘリンである23。この分子はニワトリ胚心筋mRNAのライブラリーからクローン化された。このライブラリーは、ニワトリ胚の脳から得たHA結合タンパク標品に対するモノクローナル抗体でスクリーニングされた。Cdc37はHA結合モチーフ(-B(X7)B-)を持っているが、アグリカンやリンクタンパクのようなHA結合分子に特徴的なタンデムリピートループは持っていない。Cdc37は酵母の細胞サイクルの制御に必須の成分である。HA以外にも、哺乳動物の分子は、コンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸とin vitroで結合する。哺乳動物での機能はまだわかっていないが、Cdc37はp34cdc2の活性に作用をおよぼす可能性がある。それ故、Cdc37とHAまたは他のグリコサミノグリカンとの結合は、細胞サイクルの制御で一つあるいはそれ以上の現象を媒介していると考えられる。

直近で細胞内HA結合タンパクとして報告されたものは、IHABP4と名づけられ、Cdc37と同じ技法でクローニングされた24。IHABP4は推定分子量42 kDaで細胞質に分布していた。それは複数のHA結合モチーフを含み、ニワトリ、マウス、ヒトに存在する同族体に保存されている。これは、より普遍的に存在する他のIHABPsとは違い、成体マウスの組織ではIHABP4の発現は限局して見られた。しかしながら、IHABP4の機能はまだわかっていない。

細胞骨格に結合していることが知られているCD44は、細胞表面における主要なHA受容体であり、リン酸化を受け、細胞の成長と分化に関与した制御作用を持つe。実験モデルのアテローム性動脈硬化症における新生内膜形成や、炎症プロセス、ガン転移等においては、CD44が重要な役割を演じているらしい。CD44はまた、平滑筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞などの多くの細胞におけるHAの取り込みと分解の主要なメディエイターである。いくつかの細胞では、CD44は結合したHAと共にクラスリン被覆小胞とは異なる機構でエンドサイトーシスされて細胞内移行する。HAの生物学的効果は明らかにその分子量に依存することから、細胞内に取り込まれ分解されたHAも、細胞内器官内から細胞事象を制御し続けると思われる。このことを支持するものとして、乳癌細胞においてHAの結合、細胞内取り込み、分解を可溶性CD44の過剰発現により抑制すると、細胞の浸襲性が消失したという事実が見いだされた25。このようにCD44を介して起こるシグナル伝達のいくつかはエンドソームやカベオレのような内部の場所から発信される可能性がある。HAのオリゴ糖は、平滑筋細胞の移動と増殖阻害などの種々の生物活性を持っている。これは細胞表面の受容体をブロックすることにより、HA依存性の細胞周囲マトリックス形成を阻止することによるものと推定される。同様にオリゴ糖はHAの細胞内取り込み、分解および/または移動を阻害することにより、推定されるHAの細胞内機能の一つを妨害している可能性がある。

e 本シリーズの「ヒアルロン酸レセプター、CD44」Knudson / Knudsonを参照。

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結語
現在、高分子量のHAまたはその低分子断片が、細胞内で制御の役割あるいは作用様式を示している直接的データはほとんどない。HAの細胞内作用と細胞外作用の区別は、結局は細胞内ヒアルアドヘリンの過剰発現とノックアウトを含むより多くの研究により促進されるだろう。HAが細胞内ヒアルアドヘリンを通して活発に制御に加担していることを確立するには、部位特異的突然変異を起してこれらの分子のHA結合能力をノックアウトする実験や注意深い分子機能研究が必要である。 
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